Bottom-Up 蛋白质组学如何实现精确定量？

Bottom-Up 蛋白质组学（也称分析型蛋白质组学）是一种主流的蛋白质组研究策略，指的是将复杂的蛋白质样本经过酶切（通常使用胰蛋白酶）分解为肽段后，再利用液相色谱-质谱联用技术（LC-MS/MS）对肽段进行鉴定与定量，从而推断原始蛋白质的信息。这种方法具有高通量、高灵敏度的特点，适用于复杂样本如组织、细胞或体液的整体蛋白表达谱分析。其核心理念是将复杂蛋白混合物酶切成短肽段，再通过质谱技术进行识别与定量分析。这种方法具有通量高、灵敏度强、覆盖面广等显著优势，在疾病机制研究、生物标志物发现、药物靶点筛选等领域发挥着重要作用。然而，要在 Bottom-Up 流程中实现“精确定量”，不仅需要顶尖仪器的支持，更依赖于严谨的样本制备、科学的定量策略以及精细的数据处理流程。

 

一、Bottom-Up 蛋白质组学的标准工作流程

实现精确定量的第一步是建立稳定可靠的实验流程，Bottom-Up 蛋白质组学通常包括以下几个核心步骤：

1、样本预处理与蛋白提取

从组织、细胞或体液中提取蛋白质，必须确保蛋白组尽可能完整且可重复。常见方法包括 RIPA 缓冲液裂解、尿素裂解等，过程中应加入蛋白酶抑制剂，防止蛋白降解。

 

2、蛋白质定量与标准化

在后续操作前，对蛋白浓度进行精准测定（如 BCA 法），并进行标准化处理，确保样本间蛋白总量一致，是实现后续准确定量的基础。

 

3、酶切消化与肽段净化

最常用的是 Trypsin 胰蛋白酶，其特异性裂解碱性氨基酸（K/R）残基，获得适宜的短肽。消化效率与特异性直接影响肽段的复杂度与定量质量。

 

4、高效液相色谱（LC）分离

通过反相色谱或多维色谱系统将复杂肽段混合物按疏水性或电荷分布进行分离，可有效减少质谱中信号抑制现象，提高检测灵敏度。

 

5、高分辨质谱（MS）分析

目前主流平台包括 Orbitrap、Q Exactive、timsTOF Pro 等，通过高分辨、高精度、高灵敏度的 MS/MS 检测实现肽段识别与定量。

 

6、数据分析与定量

基于原始质谱数据，通过 MaxQuant、Proteome Discoverer、Spectronaut 等软件实现蛋白定量、差异分析、功能注释及生物信息学解释。

 

二、Bottom-Up 蛋白质组学精确定量的核心技术策略

要实现真正可靠、可重复的精确定量，必须在以下几方面构建严谨技术体系：

1、定量方法的选择：标签 vs 非标签

（1）Label-Free Quantification（LFQ）

依据 MS1 肽段的峰面积或 MS2 的谱图计数实现定量

• 优点：无需复杂标记步骤，适合处理大样本量，经济高效

• 缺点：受批次差异影响较大，对仪器稳定性要求高

 

（2）同位素标记法（TMT/iTRAQ）

在肽段 N 端或赖氨酸残基上引入异重同位素标签；可实现高达 16 个样本的并行相对定量

• 优点：减少批次效应，定量重复性好

• 缺点：成本较高，存在比值压缩效应

 

（3）稳定同位素内标法（SILAC、AQUA）

将已知浓度的同位素标记肽段加入样品中，作为内源标准实现绝对定量

• 优点：可提供精确的绝对定量

• 缺点：技术复杂，适用范围有限

 

2、液相分离策略的优化

多维分离策略（如高 pH 分离 + 低 pH LC-MS）可显著提升肽段覆盖率；纳升级 HPLC 系统结合自清洗柱系统，提升灵敏度和重复性

 

3、质谱性能的保障

（1）高分辨率（>60,000）与高质量准确度（<2 ppm）是精确定量的基础

（2）DDA（数据依赖采集）与 DIA（数据非依赖采集）各有优劣，DIA 更适用于定量深度分析

（3）动态范围广泛（>5个数量级）有助于同时定量高丰度与低丰度蛋白

 

4、数据处理与批间校正

（1）利用 MSstats、Perseus、DEqMS 等开源工具进行标准化、差异分析与统计检验

（2）正确处理缺失值、批次效应、多重假设校正是实现精确定量的关键

 

三、Bottom-Up 蛋白质组学实际应用场景与科研价值

精确定量的 Bottom-Up 蛋白组学广泛应用于：

1、疾病机制研究：解析癌症、神经退行性疾病、自身免疫疾病中的差异蛋白表达

2、药物开发与靶点验证：定量评估药物处理前后蛋白表达变化，明确作用机制

3、生物标志物发现：结合机器学习筛选早期诊断或治疗预测相关蛋白

4、功能组学探索：在蛋白互作网络、信号通路富集分析中揭示潜在生物学机制

 

在百泰派克生物科技，我们不仅具备前沿质谱平台（如 Orbitrap Exploris 480、timsTOF Pro 2），更结合多种标记与非标记定量策略，为科研用户提供：高通量、多样本并行的 TMT/iTRAQ 定量服务；纳升级液质联用下的 Label-Free 深度定量；融合 DIA 技术的蛋白组全景定量分析；数据全流程生信支持，含差异分析、富集分析、互作网络构建。通过高标准的样本制备体系与定量流程，我们助力科研人员精准解读生物体系中的动态变化，推动疾病机制研究与新靶点发现进程。

 

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