Edman测序法是什么
一、基本原理
Edman 氨基酸序列测定法，又称 Edman 降解法，由埃德曼(Pehr Edman)在20世纪50年代创立。该方法切割肽段或蛋白质的N端（氨基末端）的第一个氨基酸，对切割的氨基酸通过高效液相色谱（HPLC）等技术进行鉴定，切割后的下一个氨基酸成为新的 N 端氨基酸，又可循环进行切割和鉴定。每一个循环可测定一个氨基酸，按循环顺序进行排列即可得到氨基酸的序列信息。
二、技术流程
Edman测序法的关键步骤通常包括以下几个环节如图1[1]所示：包含耦合、切割、萃取、转化和鉴定。
1.耦合：在pH 约 9.0 的碱性环境下，蛋白质N端的氨基酸与异硫氰酸苯酯(Ph-N=C=S，PITC)耦合，形成苯氨基硫甲酰(PTC)衍生物。
2.切割：苯氨基硫甲酰(PTC)衍生物与三氟乙酸(trifluoroacetic acid,TFA)发生反应，选择性地切割蛋白质 N 端的第一个肽键，使该氨基酸残基游离,生成噻唑啉酮苯胺(ATZ)衍生物。
3.萃取和转化：萃取出释放的氨基酸衍生物，并在强酸性条件下转化为稳定的乙内酰苯硫脲氨基酸(PTH-氨基酸)。
4.鉴定：利用HPLC等技术分离并检测出PTH衍生物对应的氨基酸种类。
5.循环操作：回收少了一个氨基酸的多肽链，并重复以上步骤，直到鉴定出整条多肽链的氨基酸排列顺序。
三、优点
Edman测序法具有以下几个显著优点：
1.高精度：测序结果具有很高的精准度，能够准确反映蛋白质的氨基酸序列。
2.独立性：不需要借助任何蛋白质序列数据库，可直接对任一样品进行序列分析。
3.适用性广：可以准确鉴定序列发生突变的以及人工改造过的蛋白/多肽的N末端序列。
四、应用
Edman测序法在生物学和医学领域具有广泛的应用价值，包括但不限于以下几个方面：
1.生物药物研发：在生物药物研发过程中，通过测定蛋白质药物的序列，验证其完整性和纯度，确保药物质量符合要求。同时，还可以研究蛋白质药物的降解途径和代谢途径，为药物的稳定性和代谢动力学提供重要参考。《中国药典》(2020 年版)、欧洲药品管理局(EMA)《生物类似药指南》、ICH Q6B 等多个文件中均对N端氨基酸序列的分析提出了要求，N端氨基酸序列可评价生物药物的均一性，如发现N端氨基酸存在异质性，需采用合适的方法对含量进行控制。
2.蛋白质结构和功能研究：通过测定蛋白质的序列，揭示其结构和功能之间的关系，帮助科学家理解蛋白质在生物体内的具体功能和相互作用机制。
3.蛋白质工程和突变分析：通过测定突变蛋白质的序列，评估突变对蛋白质结构和功能的影响，进一步指导蛋白质工程的优化和改进。
Edman测序法作为一种重要的生物技术手段，在解析蛋白质序列、研究蛋白质结构和功能以及推动生物药物研发等方面发挥着重要作用。
五、常见问题
1.纯度最好能达到95%以上；否则每个循环有多个氨基酸出峰，无法归属到蛋白的序列。
2.含盐过多导致无结果，甚至损坏仪器。
3.样品量太少导致无结果。
4.若蛋白质出现糖基化或N端被封闭，不能用此方法进行测试。
5.蛋白有两条或者三条链，如何进行N端序列分析？先进行SDS-PAGE电泳将条带分开，然后将胶上的蛋白转移到PVDF膜上（注：转膜时不要使用Tris-甘氨酸缓冲液，其会在N端测序中产生较高的背景，推荐使用CAPS缓冲液），丽春红染色后，分别剪切下相应的条带进行测序。
六、参考文献
[1] Zhang H, Wang B, Seehafer K, Bunz UHF. Sensor Array Based Determination of Edman Degradated Amino Acids Using Poly(p-phenyleneethynylene)s. Chemistry. 2020 Jun 23;26(35):7779-7782. doi: 10.1002/chem.202001262. Epub 2020 May 29. PMID: 32181541; PMCID: PMC7383564.
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