蛋白质测序的方法有哪些
一．背景介绍
蛋白质测序能够直接揭示蛋白质的氨基酸序列，这是理解蛋白质结构和功能的基础。蛋白测序后可以进一步地预测蛋白质的三维结构，进而解析其生物学功能和相互作用机制。这对于揭示生命活动的奥秘、理解疾病的发生和发展具有重要意义。目前的蛋白测序技术主要有：质谱从头测序、艾德曼降解测序、纳米孔测序。
二．技术流程
1.质谱从头测序：基于质谱的蛋白质测序是利用质谱仪采集肽段氨基酸序列的质量信息即二级谱图，通过从头测序算法直接从二级质谱图中解析出肽段序列，进行序列拼接后，得到完整的蛋白质的氨基酸序列。质谱法蛋白质测序的技术流程如下：样品制备→蛋白质酶解→肽段分离→质谱检测→数据分析。质谱法蛋白质测序需要注意的事项有：①样品制备过程中，尽量避免蛋白质降解；②选择合适的酶进行蛋白质酶解；③确保质谱仪性能稳定，提高数据准确性。此方法适用于各种大小的蛋白，对蛋白上发生的化学修饰也能准确鉴定。
2.艾德曼降解测序：通过一系列的化学反应来去除和识别多肽链末端的氨基酸残基，即带有游离α-氨基的残基。同时，序列中的下一个残基被暴露出来，并经过同样一轮化学反应。重复上述氨基酸鉴定反应，从N端到C端的方向依次对氨基酸序列进行分析。对于序列较长的蛋白质（多肽），还可以将样品先切成小的肽段，先对肽段序列分析，再将肽段信息进行拼接即可获得完整蛋白质的序列信息。艾德曼降解方法的局限性比较明显：较大的蛋白质无法通过Edman测序进行测序；蛋白N端经过化学修饰，无法使用此方法。
3.纳米孔测序：使用氨肽酶将肽消化为单个的氨基酸，然后利用纳米孔读取单个氨基酸的电流变化，经过机器学习算法识别氨基酸身份，最终重构出原始肽段的氨基酸序列。此方法目前仍处于研究阶段，技术还不够完善，仅能实现对单个肽段的鉴定，还不能实现完整蛋白测序。
三．研究案列
单克隆丙种球蛋白病（MGUS） 是一种浆细胞疾病，其特征是在血清中存在一种主要的单克隆抗体（即M蛋白）。作者通过液相色谱-质谱联用分析来检测人血清中IgG1型的M蛋白。使用多种蛋白酶对M蛋白进行酶切，使用从头测序方法解析得到抗体肽段，经过肽段拼接，最终确定了完整M蛋白的重链和轻链序列。此外，作者还对抗体CDR区域中的糖基化水平进行了表征。
目前应用比较多的的是基于质谱的蛋白质从头测序。蛋白质从头测序（de novo protein sequencing）是一种不依赖于任何已知的序列或者蛋白质数据库信息，直接对蛋白质氨基酸序列进行测定的全新测序技术，此技术对于鉴定全新蛋白的作用尤为突出。抗体作为我们免疫系统中必不可少的分子，是医疗诊断和治疗领域的宝贵工具，蛋白质从头测序在抗体领域中有着重要应用。
北京百泰派克生物科技有限公司基于发表在Nature Biotechnology和专业的蛋白组学杂志JPR上的文献，结合现有的专业背景知识开发了抗体序列分析的软件，具备自研的质谱原始数据计算方法，采用宽进窄出的原则，在不遗漏任何有效数据信息的同时实现了抗体/蛋白序列的准确鉴定。测序过程中会使用目前分辨率和灵敏度最高的Orbitrap Eclipse和Orbitrap Fusion Lumos质谱仪，保证数据质量和结果的准确性。蛋白/抗体测序项目周期为3至4周。
四、文献引用
[1]albertj,denboer,arjand,et al.Direct Mass Spectrometry-Based Detection and Antibody Sequencing of Monoclonal Gammopathy of Undetermined Significance from Patient Serum: A Case Study[J].Journal of Proteome Research, 2023, 22(9):3022-3028.
[2]Bandeira N, Pham V, Pevzner P, et al. Automated de novo protein sequencing of monoclonal antibodies [J]. Nature Biotechnology, 2008, 26(12):1336-1338
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