如何进行经典的Edman测序
Edman测序法，又称为Edman降解法，是一种用于测定蛋白质N-末端氨基酸序列的经典生物化学方法。以下是进行经典的Edman测序的详细步骤：
一、实验准备及纯化处理
首先修样品的信息的了解，包括体系Buffer、蛋白或多肽的纯度及特殊的修饰情况。Edman降解反应中如果蛋白质N端氨基已被乙酰基、甲酰基或焦谷氨酰胺基阻断，造成没有游离N末端与PITC反应，则须通过化学或酶促方法切割以产生具有游离N末端的片段。因此对于不同的蛋白样品类型需根据需要进行相关前处理再进行分析：
1.对于不含盐的蛋白样品，可直接滴到PVDF（聚偏氟乙烯）膜上进行Edman降解分析；
2.对于高盐蛋白溶液样品，需先进行脱盐处理。可利用可拆过滤头、注射器、PVDF膜、EP管组装简易除盐装置。PVDF膜经活化后，注入加水稀释后的样品进行清洗除盐，之后可取出加载样品的PVDF膜进行分析；
3.对于抗体样品，可先进行SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）分离后，电转印至PVDF膜上，使用丽春红染液进行染色，待自然晾干后分别剪切重链和轻链的条带，再依次进行分析。对于焦谷氨酸环化封闭样品，可利用焦谷氨酸氨肽酶先进行焦谷氨酸去除，再进行SDS-PAGE电泳和电转印，之后再进行分析。
二、Edman测序上机步骤
1.耦合（Coupling）
试剂选择：使用异硫氰酸苯酯（PITC）作为Edman试剂。
反应过程：在温和的碱性条件下，PITC与蛋白质的N端氨基发生反应，形成苯硫氨酰（PTC）加合物。这一步是标记N端氨基的关键步骤。
2.分离（Cleavage）
试剂选择：使用强酸（如三氟乙酸）进行处理。
反应过程：在强酸的作用下，PTC-肽发生环化裂解，N末端氨基酸被选择性地切断，并释放出该氨基酸残基的噻唑啉酮苯胺（ATZ）衍生物。这一步实现了对N端氨基酸的切割。
3.转换（Conversion）
处理过程：将ATZ衍生物转化为更稳定的苯乙内酰硫脲（PTH）衍生物。这一步是为了提高后续测定的稳定性和准确性。
4.循环与鉴定
循环过程：上述耦合、分离和转换步骤构成一个循环，每个循环可以测定一个N端氨基酸。通过多次循环，可以逐步测定出整个N端序列。
鉴定方法：通常使用高效液相色谱（HPLC）等技术来分离和鉴定每次循环中产生的PTH氨基酸。根据PTH氨基酸的质谱图或色谱图，可以确定其对应的氨基酸种类。
三、数据分析与解释
1.收集数据：记录每次循环中产生的PTH氨基酸的种类和数量。
2.序列拼接：根据每次循环中测定的氨基酸种类，按照顺序拼接成完整的N端序列。
3.结果验证：通过比对已知蛋白质数据库或进行其他实验验证，确保测序结果的准确性和可靠性。
四、注意事项
1.适用范围：Edman测序法通常适用于中等大小（通常小于50个氨基酸）的蛋白质或肽段。对于较大的蛋白质，可能需要采用其他测序方法，如质谱法。
2.特殊氨基酸处理：某些氨基酸（如脯氨酸）可能会影响Edman测序的准确性，因此可能需要特殊处理或采用其他方法进行测定。
3.N末端封闭的样品：从反应原理可知，N末端的α-氨基被修饰后，反应无法进行。
4.关注的N端序列中有太多非标准氨基酸，由于没有相应的标准品，也没有办法通过N端测序来分析。此时可改用质谱法进行序列确证。
通过以上步骤，可以完成经典的Edman测序，从而揭示蛋白质的N端氨基酸序列。这一方法在研究蛋白质的结构和功能、解析蛋白质相互作用以及药物研发等领域具有广泛的应用价值。
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