如何使用ABPP开展小分子筛选与机制研究？
在药物发现与机制研究的早期阶段，传统的高通量筛选（HTS）方法虽然能从上万种小分子中识别活性化合物，却难以回答一个关键问题：“它是如何发挥作用的？”这正是活性位点标记的蛋白质组学技术——活性基团标记的蛋白质谱分析（Activity-Based Protein Profiling, ABPP）的切入点。ABPP（Activity-Based Protein Profiling，活性基础蛋白质谱分析）是一种基于化学探针的技术，广泛用于筛选小分子药物、识别作用靶标以及研究作用机制。其核心思想是利用活性位点特异性探针，对特定酶类或蛋白质家族进行活性标记，并结合蛋白质组学方法进行分析。它不依赖于蛋白丰度，而是直接识别功能活跃状态下的酶类蛋白，已成为新型小分子筛选、靶标鉴定和作用机制解析的强大工具。随着共价抑制剂和蛋白质降解技术的兴起，小分子药物越来越强调“作用方式”的可控性。ABPP作为连接蛋白功能状态与小分子识别机制的桥梁，正在。ABPP有望实现更高通量、更精细分辨率的功能蛋白图谱绘制。未来，如何在结合化学遗传学、AI辅助结构预测和单细胞质谱情况下，使用ABPP开展小分子筛选与机制研究是科研人员重新定义早期药物筛选的重要课题。
一、ABP结构三要素
1、反应基团（Warhead）：与酶活性位点共价结合，常见如氟磷酰基、环氧基、磺酰氟等
2、连接臂（Linker）：调节探针空间构象，减少非特异性结合
3、可报告标签（Tag）：用于后续富集（如生物素）或检测（如荧光团、光敏交联基团）
二、ABPP在小分子筛选中的应用
1、选择合适的ABPP探针，探针结构一般包含三部分：
（1）反应性基团（Warhead）：特异性结合活性位点（如丝氨酸酯酶的氟磷酰基）。
（2）连接臂（Linker）：提供空间灵活性。
（3）标签（Tag）：用于检测（如荧光基团、生物素）或后续click反应（如炔基/叠氮基）。
2、设计竞争性ABPP实验
将待筛选的小分子先与细胞裂解液或纯化酶孵育。然后加入ABPP探针。如果小分子与酶的活性位点结合，会竞争性抑制探针标记，从而减少信号。
3、检测与筛选
使用SDS-PAGE + 荧光成像、生物素标记+Western blot、或者MS质谱定量等方式检测探针结合程度。比较加入小分子前后的差异，即可判断其是否具有抑制作用。
三、工作流程简述
1、探针处理样本（细胞/组织裂解液或原位）
2、与靶标蛋白结合形成共价键
3、富集标记蛋白，进行质谱鉴定
四、ABPP在小分子筛选中的应用策略
1、竞争型ABPP（Competitive ABPP）：识别小分子作用靶标
在该策略中，小分子药物先与体系孵育，再加入ABP。若小分子占据了酶的活性位点，则ABP的结合将被抑制，从而导致其在目标蛋白上的标记减少。通过定量质谱分析不同处理组之间的差异，可以：
（1） 筛选出与小分子竞争结合的酶类靶标
（2）解析小分子可能的作用机制与选择性
2、反应谱（Reactivity Profiling）：发现新颖活性酶
ABPP可以用来绘制特定组织、细胞类型或病理状态下的“酶活性图谱”。这为靶标未知的小分子提供背景信息，有助于推测其可能的干预路径。
3、用于酶类家族的选择性优化
在共价抑制剂开发中，ABPP尤其适用于筛选具有家族成员差异性的抑制剂。
五、ABPP结合质谱的技术亮点
六、注意事项
1、探针的选择要根据酶类（如丝氨酸酯酶、胱氨酸酶、氧化还原酶）特异性设计。
2、小分子的可渗透性和稳定性对结果影响大。
3、注意非特异性结合和背景信号的控制。
在百泰派克生物科技，我们基于高分辨Orbitrap平台，提供ABPP+TMT多标记定量、ABPP+SILAC稳定同位素标记等高级定量方案，助力客户解析小分子与酶的精确互作。已构建包括ABPP、DIA定量、磷酸化修饰分析在内的多元平台解决方案。我们致力于帮助科研工作者在机制研究和靶点发现上少走弯路、快速验证假设，为生命科学与创新药物研发赋能。
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