蛋白质N端测序方法:Edman降解法or质谱法

N端是一个蛋白质或多肽的起点。它影响蛋白质的亚细胞分布、降解和转化率。因此,蛋白n端序列分析对于蛋白质功能研究具有重要意义。此外,在药物蛋白质中经常观察到一些N端的变化,包括N端信号序列的不完全处理、焦谷氨酸盐的形成、以及N端甲硫氨酸残基的去除缺乏。因此,N端测序是一项重要的质量控制分析。ICH Q6B也要求对药物进行N端序列确认。

Edman降解法N端测序:Edman测序反应是一个循环过程,N端氨基酸残基被反复裂解,可使用色谱法对分离出的氨基酸进行鉴定。因偶联和裂解反应的效率不是100%,限制了可测序的残基数。

优点:1. 可以准确分析N端氨基酸序列,特别是能辨别异亮氨酸和亮氨酸、谷氨酰胺和赖氨酸;2.直接分析氨基酸信息,不需要任何蛋白质数据库。因此,它可以识别未登记在数据库中的未知蛋白质;
缺点:1. N端已被化学修饰或封闭的肽不可用;2. 低通量分析。

关于样品:蛋白质可以以SDS或天然聚丙烯酰胺凝胶片的形式在溶液中,或印迹到PVDF膜上提交。
溶液中:样品应无干扰缓冲液、盐和洗涤剂。如果干扰缓冲液、盐不可避免,清理后仍有可能对材料进行测序。应避免缓冲液中的胺(如Tris、乙醇胺和甘氨酸)。
凝胶中:将感兴趣的凝胶切片切下来,放入微量离心管中。蛋白质可以从聚丙烯酰胺中洗脱下来。凝胶染色尽量使用考马斯蓝R-250或G-250代替银染色剂。
PVDF膜上:将SDS-PAGE分离的蛋白质印迹在PVDF膜上。蛋白质可以用考马斯蓝R-250、酰胺黑、胭脂红S或Sypro Ruby染色(不建议银染)。

相关服务

基于Edman降解的蛋白质N端测序

质谱法N端测序:在基于MS的测序中,蛋白质被消化酶预处理消化成小片段,然后用质谱仪分析。由于大多数氨基酸残基的质量不同,不同的肽段可以产生有不同m/z和不同谱图的碎片离子。质谱法可以用于N端测序和C端测序。

优点:1.能获取更长的N端序列信息;2.可分析N端封闭和PTMs;
缺点:1. 等重的氨基酸不能确定;2.肽序列的覆盖率很少是100%。

关于样品:凝胶和液体蛋白样品均可以接受,样品纯度应尽可能高。质谱分析是一项非常灵敏的技术,因此样品必须仔细准备。可能污染样品的因素,例如,由于多蛋白复合物的不完全亚细胞分离或纯化,样品被高丰富的蛋白质压倒,以及来自皮肤或毛发的污染。应消除任何可能引入污染蛋白质的来源。

相关服务

基于质谱的序列分析

Edman测序流程图

Edman测序流程图

质谱测序流程图

质谱测序流程图

Edman降解法N端测序和质谱法N端测序各有特点。Edman测序可以准确分析N端氨基酸序列,特别是能辨别异亮氨酸和亮氨酸、谷氨酰胺和赖氨酸。我们的蛋白质测序系统自动进行Edman反应、HPLC分离和检测,以及数据分析。对于基于MS的N端测序,我们可以通过高分辨率质谱分析N端封闭和翻译后修饰(PTMs),可通过使用两种或三种不同蛋白酶的组合来增加序列的覆盖率。

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