翻译后修饰的常用研究策略

什么是蛋白质的翻译后修饰?

蛋白质的翻译后修饰(post-translational-modification-analysis.html)是指蛋白质在翻译后的化学修饰。对于大部分的蛋白质来说,这是蛋白质生物合成的较后步骤。PTM是细胞信号传导中的重要组成部分。通过向修饰基团添加一个或多个氨基酸残基或通过蛋白质水解切割该基团来改变蛋白质的性质,是蛋白质生物学功能表达的重要步骤。生物蛋白质的翻译后修饰极大地增加了蛋白质结构的类型和功能。这个过程调节细胞周期和蛋白质转录,并影响表观遗传学。

翻译后修饰的类型

翻译后修饰的类型包括N端fMet或Met的去除、二硫键的形成、化学修饰和肽键的裂解,其中磷酸化是最常见的。蛋白质的化学修饰反应是在维持蛋白质的完整性和功能性的基础上,通过基于其氨基酸残基的化学反应获得新的生物结合物。

修饰

修饰

翻译后修饰在哪里发生?

翻译后修饰主要发生在氨基酸侧链或蛋白质的C端或N端。现有的官能团或新官能团的引入可被用于修饰蛋白质,以扩展20个标准氨基酸的化学组成。翻译后修饰的位点通常带有可以在化学反应中充当亲核试剂的官能团,如丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的羟基;赖氨酸、精氨酸和组氨酸胺形式;同时,在蛋白质的N端和C端,天冬酰胺也可作为翻译后修饰中的一种聚糖连接点。翻译后修饰也发生在氧化的蛋氨酸和侧链位点的一些亚甲基上。

翻译后修饰的研究策略

目前,有几种分析蛋白质翻译后修饰的策略,包括质谱(MS)、Eastern blotting、放射性标记和Western blotting。放射性标记和Western blotting是最传统、特异性和相对定量的方法。该过程需要事先知道翻译后修饰类型。局限性包括抗体的特异性和可用性。质谱技术也常被用于翻译后修饰分析,不受修饰类型和相关修饰位点的现有知识的限制。

自下而上
自下而上的技术是蛋白质组学研究中使用的质谱策略之一。在根据序列鉴定肽之前,需要使用蛋白酶消化蛋白质。由于该技术不能保证在检测过程中被检测肽的完整性和稳定性,因此无法获得不同蛋白质翻译后修饰之间关系的信息,这意味着它无法检测到某些修饰。因此,该方法不适用于分析组蛋白的组合翻译后修饰。

自中而下
自中而下的分析方法是自下而上分析方法的一种替代方法,分析组蛋白时其原理类似于自下而上分析策略。在使用这种分析方法时,通常需要将被检测蛋白质消化成3-9kDa范围内的肽段,因此也无法保证检测到的肽段的完整性。但是,由于仪器的进步和保留了组蛋白尾部的组合修饰,自中而下分析法正逐渐受到欢迎。自中而下更接近于自下而上法的灵敏度。

自上而下
自上而下技术可以直接对完整的蛋白质进行测序,包括翻译后修饰的蛋白质和其他大的蛋白质片段,而不仅仅是肽段。这可以最大程度地保留与PTMs相关的信息,使其适用于组蛋白的全面表征和分析。自上而下技术对蛋白质的有效分辨率已达到229kDa,一次可以检测到的蛋白质数量也在增加。目前,Top-down技术主要用于分析单个蛋白质,高通量分析技术尚未得到广泛应用。

修饰策略

自下而上和自上而下策略用于蛋白质鉴定和表征示意图(Scherperel et al.,2007)

参考文献
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5. Scherperel G, Reid G E. Emerging methods in proteomics: top-down protein characterization by multistage tandem mass spectrometry. Analyst, 2007, 132.

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