Pull-down实验和免疫共沉淀

Pull-down实验及原理

Pull down是一种研究蛋白质或RNA与蛋白质相互作用的体外方法,这里主要讲研究蛋白与蛋白互作的pull-down实验。在Pull-down实验中,首先要利用基因重组技术构建含有亲和标签与诱饵蛋白基因的载体,然后通过表达纯化得到带亲和标签的诱饵蛋白,该诱饵蛋白可固定在某种基质上以吸附细胞裂解液中的能与诱饵蛋白互作的蛋白,之后再通过洗脱即可得到目的蛋白,对目的蛋白进行检测可实现诱饵蛋白与目的蛋白相互作用的分析。

Pull-down实验的基本原理是将一种含亲和标签的蛋白质作为“诱饵蛋白”固定于某种基质上,当细胞或组织裂解液经过该基质时,可与“诱饵蛋白”相互作用的蛋白就会被吸附,而没有被吸附的其他蛋白质则被洗脱液洗脱,被吸附的蛋白可以通过改变洗脱液或洗脱条件而被回收,从而获得能与已知蛋白(即带亲和标签的诱饵蛋白)相互作用的蛋白。诱饵蛋白上的亲和标签是pull down实验的基础。常见的诱饵蛋白的亲和标签包括谷胱甘肽S-转移酶(GST)标签和多组氨酸(6×His)标签。Pull-down实验后可以对获得的互作蛋白进行电泳分析或质谱鉴定等,以确定已知蛋白或发现未知蛋白。

Pull down串联质谱

Pull down实验也叫做蛋白质体外结合实验,是一种在体外研究蛋白质与蛋白质相互作用的简单而灵敏的技术。Pull-down实验,通过带亲和标签的诱饵蛋白可以把细胞或组织裂解液中与诱饵蛋白相互作用的蛋白质拉下来。串联质谱用于被拉下来的蛋白质的分析鉴定,然后就可以确认与诱饵蛋白互作的蛋白是不是研究者预想的蛋白质,以及得到互作蛋白是什么蛋白等信息。

免疫共沉淀

免疫共沉淀(Co-IP)是一种研究天然状态下蛋白质与蛋白质相互作用的技术。在Co-IP实验中,首先要使用非离子型表面活性剂来裂解细胞或组织样品以更好的保留完整的蛋白质与蛋白质相互作用,然后加入某一蛋白(诱饵蛋白)的专一性抗体,该抗体与诱饵蛋白结合使诱饵蛋白沉淀,同时也可以沉淀与诱饵蛋白相互作用结合在一起的其它蛋白,也就是实现共沉淀,之后通过洗脱即可得蛋白复合物(诱饵蛋白与其互作蛋白的复合物),对产物进行检测可实现互作蛋白的分析。

Pull-down实验和免疫共沉淀

通过上面的介绍,我们可以发现Pull-down实验和Co-IP免疫共沉淀在实验原理和步骤上都有不同之处。此外还需要注意的是,pull-down是体外研究蛋白互作,而Co-IP是研究天然状态下的蛋白互作。具体用哪种方法进行实验,研究人员可以根据实际需求选择。

相关服务

GST pull-down蛋白相互作用分析
CO-IP免疫共沉淀法蛋白互作分析
蛋白质相互作用分析

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