基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱MALDI-TOF质谱仪

质谱是一种分析技术,它将样品离子化成带电分子,并可以测量它们的质荷比(m/z)。在基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱MALDI-TOF质谱中,离子源是基质辅助激光解吸电离(Matrix-assisted laser desorption/ionization, MALDIMALDI),质量分析器是飞行时间(time of flight, TOF)分析器。

基质辅助激光解吸电离MALDI

MALDI是一种软电离技术,它使用激光撞击小分子基质使分析物分子进入气相而不会被碎裂或分解。一些生物分子太大,加热时会分解,传统技术会碎裂或破坏大分子。MALDI适合分析肽、脂质、糖类或其他有机大分子等生物分子。

基质辅助激光解吸电离的原理

MALDI电离分析物

MALDI电离分析物

分析物被包埋在大量过量的基质化合物中,该基质化合物沉积在一种称为靶标的固体表面上,该靶标通常由导电金属制成并具有用于多种不同样品的斑点。在一个非常短的激光脉冲之后,被照射的点被迅速加热并被振动激发。基质分子从样品表面大力消融,吸收激光能量并将分析物分子带入气相。在消融过程中,分析物分子通常通过被附近的基质分子质子化或去质子化而被电离。最常见的MALDI电离形式是使分析物分子带有单个正电荷。

MALDI中常用的激光类型

紫外(UV)波长和红外(IR)波长的激光均被使用,但UV激光是目前为止MALDI分析中最重要的光源。其中,氮气激光和三倍频或四倍Nd:Yag激光常用于大多数应用。IR-MALDI主要由Er:Yag激光主导,而TEA-CO2激光则很少使用。

常用的MALDI基质物质

一般认为,基质的第一功能本质上是稀释和分离分析物分子,这发生在溶剂蒸发和固溶体伴随形成的过程中。然后,在激光照射下,它充当能量吸收的介质。选择正确的基质是MALDI成功的关键。通常,高极性分析物在高极性基质中更好,非极性分析物最好与非极性基质结合使用。如下表所示,不同的基质已被找到并被广泛使用。当前,最常用的基质是α-氰基-4-羟基肉桂酸、2,5-二羟基苯甲酸、3,5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸和2,6-二羟基苯乙酮。

MALDI-TOF质谱仪1

UV-MALDI基质(Gross J.H.,2006)

飞行时间(TOF)分析器

MALDI-TOF质谱仪2

MALDI-TOF质谱仪2

飞行时间的原理


TOF的基本原理是不同m/z的离子在沿已知长度的无场漂移路径飞行时会在时间上分散。假设所有离子同时或至少在足够短的时间间隔内开始飞行,较轻的离子将比较重的离子更早到达检测器。

线性TOF分析器和反射TOF分析器


理论上,所有离子都具有相同的初始动能,因此沿无场区漂移后,相同m/z的离子会同时到达检测器。但是,实际上并非所有离子都以相同的强度感知脉冲,因此并非所有具有相同m/z值的离子都能达到其理想速度。为了解决这个问题,通常在漂移区的末端应用反射器。反射器由一系列具有高电压的环形电极组成,通常以微小的位移角将离子沿飞行管击退。

具有不同动能的离子在被反射器反射到相反的方向之前,穿透反射器的深度不同。携带较多动能的较快离子将比较慢的离子有更长的路径,因此,较快离子与携带较少能量的较慢离子相比在反射器中花费的时间更多。以这种方式,检测器在(大约)同一时间接收相同质量的离子。因此,TOF质量分析器的这种设计大大提高了其分辨率。然而,反射TOF分析器不适用于在电场作用下不稳定的分析物。

MALDI-TOF质谱分析的过程

MALDI-TOF质谱仪3

MALDI-TOF质谱仪3

分析物在溶剂中的溶解度应至少约0.1mg/ml。并将基质溶解为饱和溶液或浓度约10mg/ml。然后将分析物的溶液与基质的溶液混合。为了优化MALDI光谱,通常将基质与分析物的摩尔比调整为1000:1至100,000:1。然后将混合物点到金属靶板上进行分析。干燥后,样品和基质的混合物共结晶并形成样品固体沉积物嵌入基质。随后将金属板装载到MALDI-TOF仪器中,并通过与系统相应关的软件进行分析。MALDI使样品和基质升华且电离。TOF分析器根据m/z分离这些生成的离子,MS软件生成和分析这些离子的谱表征,最终生成MS谱图。

MALDI-TOF质谱的应用

完整质量测定
完整的质量测定是蛋白质表征的基础且至关重要,因为一个蛋白质的正确分子量可以指示完整的结构。MALDI是一种软电离技术,适用于通过其他电离方法电离时易碎的蛋白质。MALDI-TOF MS的性能受缓冲液成分、去污剂和污染物的影响较小。此外,它允许以足够的精度(≤500ppm)进行完整的蛋白质质量测定用于序列验证。在蛋白质消化后,MALDI-TOF MS也可用于分析获得的肽段,通过肽质量指纹图谱进一步确认一级结构。

肽质量指纹图谱(PMF)
MALDI-TOF质谱仪操作简单、质量准确度高、分辨率和灵敏度高。因此,它在蛋白质组学中有着广泛的用途,通过一个称为肽质量指纹图谱的方法从简单混合物中鉴定蛋白质,该方法通常与二维凝胶电泳(2-DE)结合使用。在这种方法中,通过用序列特异性酶(如胰蛋白酶)消化目标蛋白来产生肽段。然后通过MALDI-TOF质谱分析肽段,获得肽段质量。将实验得到的质量与数据库中的进行比较,数据库包含来自有相同序列特异性蛋白酶的给定生物的理论肽质量。

源后降解(PSD)MALDI-TOF分析
配备反射器的MALDI-TOF质谱仪可以分析由在飞行中自发分解的前体离子产生的碎片离子。这种离子通常被称为亚稳态离子,在离子源与反射器之间的无场区中的分解过程通常被称为PSD。PSD碎片离子在进入反射器之前在无场区内形成。通过连续改变反射器电压可以分离、收集和记录PSD碎片离子,形成PSD质谱图,为肽和蛋白质的一级结构提供非常丰富和有效的结构信息。在蛋白质组学研究中,某些2DE分离的蛋白质样品无法通过PMF鉴定或鉴定结果不清楚。PSD测序功能可以应用于这些蛋白质的鉴定。使用PSD波谱学,结合数据库搜索,可以快速且高度特异地鉴定蛋白质。

寡核苷酸分析
随着分子生物学技术和反义核酸药物技术的发展,越来越多的寡核苷酸片段被合成用作引物、探针和反义药物。快速检测这些片段以确定合成是否完整以及合成的序列是否正确是完全必要的。质谱技术,包括MALDI-TOF-MS,是迄今为止最好的方法。使用MALDI-TOF-MS进行寡核苷酸分析简单、快速、准确和灵敏,可用于测定完整的寡核苷酸序列。

MALDI成像
MALDI-TOF可用于直接从薄组织切片中对蛋白质进行分析和成像,这被称为MALDI成像质谱(MALDI-IMS)。它提供了所分析部分中肽和蛋白质的局部分子组成、相对丰度和空间分布的具体信息。MALDI-IMS可以通过一次测量同时分析生物组织切片中的多种未知化合物,在保持组织中细胞和分子完整性的同时获得组织的分子成像。

MALDI-TOF质谱仪可以分析各种生物分子,例如肽、蛋白质、碳水化合物、寡核苷酸等。由于形成的离子具有较低的内能,MALDI-TOF的一大优势在于软电离过程可以观察到电离的分子而分析物几乎不碎裂,从而鉴定分析物的分子离子,即使在混合物中也可以。而且,它易于使用和维护,且数据采集速度快。选择合适的基质物质对于MALDI-TOF质谱分析的成功很重要。

相关服务

分子量测定
肽质量指纹图谱(PMF)

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