蛋白质测序

蛋白质测序是生物学和医学研究领域中必不可少的技术，它能够分析氨基酸序列、确认蛋白质结构和功能、鉴定新的蛋白质生物标志物和药物靶标、构建系统发育树以了解进化关系，以及鉴定直系同源和旁系同源蛋白质。此外，它还有助于推断未知直系同源蛋白的功能，促进cDNA文库筛选，支持蛋白质工程研究。该技术主要关注多肽的共价结构和氨基酸序列，是翻译后修饰研究的关键一环，深刻解释了蛋白质结构与功能的紧密联系。

一、蛋白质测序的基础知识

蛋白质测序可分为三种主要策略：研究N末端、探索C末端（方法有限，通常涉及羧肽酶）和将多肽分解为肽。

研究蛋白质的结构和功能十分重要，因为它们是生命活动的主要承担者，可以在纳米水平上调控生物功能，负责维持生命、复制、防御和繁殖。这些蛋白质分子通常由20种天然氨基酸组成，是所有细胞工作的基础。通过研究蛋白质，我们可以更好地了解疾病的原因、生命的进化过程以及地球上生命的奥秘。

二、蛋白质测序的方法

传统的蛋白质测序方法，如Edman降解技术，通过逐步去除肽链氨基端的氨基酸残基，确保蛋白质的完整性。而与之相比，下一代蛋白质测序（NGPS）则凭借先进的科技手段，能够全面而精准地识别生物体内各类蛋白质，这种技术进步为疾病研究和免疫治疗带来了前所未有的潜力与应用前景。

1. Edman 降解法

Edman降解技术是一种通过系统地从肽链的氨基端逐个去除氨基酸残基来解析蛋白质的方法。Pehr Edman针对水解过程中可能导致的蛋白质损伤问题提出了解决方案。他并没有采用苛刻的条件，而是引入了一种新颖的标记和裂解方法，即在肽链的N-末端添加苯异硫氰酸酯（一种苯硫代氨基甲酰衍生物）。在较为温和的酸性条件下，N-末端的裂解会发生，形成一种称为苯硫代茚三酮（PTH）-氨基酸的环状化合物。这一过程能够保持蛋白质的完整性，留下两个肽序列组分。此过程可以针对每个残基进行迭代，从而在不破坏整体蛋白质结构的情况下，依次分离出单个残基。

Edman技术在对分子量较大的蛋白质进行测序时面临效率较低的挑战。为了克服这一局限性，可以采用分而治之的策略，将较大的蛋白质分解成易于测量的氨基酸片段。这个过程关键在于运用特定的化学试剂或酶对蛋白质氨基酸残基进行特异性切割。所得的较小肽可以通过色谱法分离，然后进行Edman测序，因为它们的尺寸减小，就可以更有效和准确地测定其氨基酸序列。

2.基于质谱的技术

质谱法是目前测定蛋白质质量和结构的首选方法。它涉及离子化、带电粒子加速进入质谱分析器，以及基于质量与电荷比（m/z）成正比的偏转进行检测。对于分子量大的蛋白质，样品引入方法包括扩散、液体注射或激光解吸。液质联用技术（LC-MS），即高效液相色谱与质谱法联用，可用于分析复杂的混合物。

LC-MS现已成为常用技术，它采用电喷雾电离（ESI）来实现可靠的界面。该技术适用于各种生物分子，串联质谱和稳定同位素的使用增强了灵敏度和准确性。尽管需要优化方法以减少离子抑制，但快速扫描能够实现多路复用，在一次运行中测量多种化合物。随着仪器价格逐渐亲民，LC-MS技术在临床生物化学中的重要性日益凸显，正与传统方法如液相色谱和免疫测定法展开竞争。

四级杆质谱仪常用于串联质谱法（MS/MS）中，它根据不同的m/z比值选择离子，并利用碰撞诱导解离（CID）在离子阱中碎裂所选离子，从而确定肽/蛋白质序列。该技术通常涉及两个由碰撞室分隔的质量分析器，但也可以利用四级杆离子阱在单个质量分析器中完成。

质谱法在临床实验室中展现出了诸多显著优势，包括高度的特异性、灵敏度，以及高通量和成本效益高的检测能力。然而，与此同时，它也面临着一些不容忽视的挑战，特别是治疗性药物监测检测领域缺乏标准化的问题，以及实验室自主开发的检测技术（LDTs）面临着FDA额外监管的潜在风险。

三、蛋白质测序的挑战和局限性

1.翻译后修饰（PTMs）

PTMs涉及某些蛋白质合成后氨基酸侧链的改变，是控制多种细胞过程的重要分子调控机制。这些修饰过程包括蛋白水解裂解以及乙酰基、磷酰基、糖基和甲基等修饰基团添加到一个或多个氨基酸中，它们在众多生物过程中起着关键作用，极大地影响了蛋白质地结构和动力学。

2.蛋白质序列的复杂性

蛋白质序列的复杂性，特别是那些表现出明显无序或含有低复杂度片段的序列，为通过质谱法实现高效且一致的测序带来了不小的挑战。同时，蛋白质序列的异质性和复杂性也为计算工作带来了难题，这使得蛋白质序列比对算法的开发与维护变得更为艰巨。特别是在处理远程相互作用以及β-折叠蛋白质采样中的组合问题时，复杂性进一步增加。

3.膜蛋白疏水特性

膜蛋白的疏水特性使得其测序过程尤为复杂，涉及过表达、纯化和结晶等多个环节，这也为膜蛋白测序带来了诸多挑战。且传统的蛋白质测序技术，如核磁共振（NMR）和X射线衍射，在解析膜蛋白结构方面也存在明显的局限性。

四、最新进展和未来展望

尽管面临挑战，但蛋白质测序领域仍在不断取得最新进展。新的测序平台和算法的开发，提高了测序的精度和效率。

1.生物信息学

生物信息学在蛋白质组学和基因组学中发挥着重要作用。在RoseTTAFold框架内，RFdiffusion使用引导扩散来生成新的蛋白质结构，而Protein MPNN则是设计蛋白质序列的强大工具。RoseTTAFold利用深度学习，仅基于氨基酸序列就能快速、准确地预测蛋白质结构。另外，Rosetta软件套件集合了用于蛋白质结构的计算建模和分析算法。而Foldit是一款免费的桌面游戏，通过发挥人们的创造力和才智，为蛋白质设计提供协作平台，使个人能够为蛋白质设计做出贡献，同时让计算机和研究人员能够共同聚焦关键领域。

通过使用测序方法，我们能够实时监测接受治疗的患者体内新出现的突变，为疾病的精准治疗提供重要依据。同时，对原发疾病的基因组进行深入表征，有助于揭示分子途径的奥秘，进而提出个性化的生物标志物，精准监测患者病情的进展，为临床决策提供有力支持。

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