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生物制药N端测序

Edman降解(埃德曼降解)法,是由菲尔•埃德曼(Pehr Edman)首先创立用于肽链或蛋白质中N-端氨基酸序列分析的方法。Edman降解法检测的原理非常简单,在碱性条件下反应,用异硫氰酸苯酯(Phenylisothiocyanate, PITC)与待检测的蛋白质(多肽)的N-端氨基生成苯氨基硫甲酰(PTC)的衍生物,然后处理-关环-选择性切断肽链N-端,得到N-端氨基酸残基的噻唑啉酮苯胺衍生物。接着用有机溶剂萃取衍生物,在酸的作用下,不稳定的衍生物转变为稳定的的乙内苯酰硫脲(PTH)衍生物,余下肽链中的酰胺键不受影响。通过用HPLC或电泳法分析生成的乙内酰苯硫脲氨基酸(PTH-氨基酸),可以鉴定出氨基酸类别。重复氨基酸鉴定反应可以达到对N端氨基酸按照从N端到C端的方向依次对氨基酸序列进行分析。对于序列较长的蛋白质(多肽),还可以将样品先切成小的肽段,先对肽段序列分析,再将肽段信息进行拼接即可获得完整蛋白质的序列信息。

百泰派克生物科技提供基于Edman降解对蛋白质(多肽)进行N端氨基酸序列分析的技术服务.
蛋白质N端测序流程

Edman降解法用于N端测序的优点:

1. PITC与所有氨基酸残基的反应产率和回收率高,因此副产物少,可通过色谱进行准确鉴定;
2. 反应时间快,对于大多数氨基酸残基来说,30min耦合时间,5min切割反应时间即可;
3. 反应后的肽链仍然是完整的,可用Edman降解法重复测定新生的N末端氨基酸。

Edman降解法用于N端测序需要注意的问题:

1. 样品纯度需 >90%, 盐离子含量在50mmol/L之内,不含SDS等变性剂,N端必须是均一的高纯样品;
2. 10Pmol 样品可以测定20 aa;
3. 液体样品不能含有蛋白酶,建议尽早测试,防止时间太长容易降解;
4. 转膜样品在转膜前不宜放置太久以防样品扩散,转膜后可密封保存3-6个月, 建议使用Coomassie R-250进行染色,电泳缓存液建议使用CAPS buffer;
5. 样品无信号峰是,建议蛋白进行N-端封闭;
6. 建议整个反应过程中尽可能使用高纯buffer。

案例分析:

百泰派克生物科技采用岛津公司推出的PPSQ系列仪器实现对蛋白或者多肽样品N端氨基酸序列的分析,可以分析N端30个以上的氨基酸。以下是我们对某一蛋白药物进行分析的实际色谱结果,该项目对样品中蛋白药物的前15个氨基酸进行了分析。从下图(第15个氨基酸的色谱图)可以看出,色谱峰值仍然非常高,可以得到非常准确的结果。

中/英文项目报告

在技术报告中,百泰派克会为您提供详细的中英文双语版技术报告,报告包括:

1. 实验步骤(中英文)
2. 相关的质谱参数(中英文)
3. 质谱图片
4. 原始数据
5. 生物药物N端序列信息

生物药物N端序列测定一站式服务

您只需下单-寄送样品
百泰派克一站式服务完成:样品处理-上机分析-数据分析-项目报告

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