生物制品表征之HPLC肽图分析
随着现代医药工业的进展，肽图分析已成为生物制品表征过程中的关键步骤和质量控制的重要手段。肽图检测法利用特定的化学试剂或酶将蛋白质特异性地降解为肽段，然后通过可靠的方法进行分离和鉴定，并与经同一方法处理的对照品进行比较和结果判定。根据所选用的检测仪器不同，肽图分析可分为基于高效液相色谱法的HPLC肽图分析和基于质谱法的HPLC质量肽图分析。
北京百泰派克生物科技有限公司BTP通过CNAS/ISO9001双重质量体系认证，建立七大检测平台。BTP基于高效液相色谱仪和液质联用仪，建立了HPLC肽图和HPLC质量肽图分析平台，并通过CNAS实验室认可。我们可以为您提供直接的HPLC肽图和HPLC质量肽图分析服务，并提供包括方法学建立、验证和转让的完整服务。
一、基于反相高效液相色谱法的HPLC肽图分析
反相高效液相色谱（RP-HPLC）法是一种分辨率高、检测灵敏度好的分析方法，可提供丰富的蛋白质和肽段信息，是蛋白质和肽段分析与表征的标准方法。HPLC肽图分析通常用于常规鉴别试验。在该分析中，肽段经过色谱柱分离后，使用UV检测器在波长范围200-230nm（通常为214nm）记录色谱图。通过将供试品溶液的色谱图与对照品进行比较，最终可以用于产品放行实验中的鉴别试验，评估批间一致性和生产用细胞基质表达的稳定性。
HPLC肽图分析的常规实验步骤包括供试品的预处理、蛋白质特异性裂解、肽段的分离和检测，以及结果的分析和判定。
实验仪器：
高效液相色谱（紫外检测器）（2695/2996）
实验结果展示：
蛋白酶解后的样品经过高效液相色谱的分离，紫外检测器采集数据，得到肽图结果，色谱图如下：
图1 参比品的色谱图
图2 样品的色谱图
根据上述色谱图分析结果，可以发现样品中的肽图峰形和出峰时间与参考样品基本一致。
方法学验证内容展示：
二、基于质谱法的HPLC质量肽图分析
HPLC质量肽图分析利用高效液相色谱串联高分辨质谱（LC-MS/MS）平台进行检测。HPLC质量肽图分析通过色谱分离技术有效地分离肽段，并通过质谱检测器进行定性分析，确定各色谱峰对应的肽段并在肽图谱中进行归属，形成具有特征性指纹的肽图谱。HPLC质量肽图分析能够提供待测样品的全面信息。通过镜像图的比较，可以评估不同批次之间的稳定性，或者判断每批样品与标准品之间是否存在差异，并对不一致的位置进行准确鉴定。此外，该方法还可以应用于蛋白变异体的定性分析、二硫键定位、糖基化位点分析以及蛋白修饰位点的确定等。
实验仪器：
• 液相色谱仪: UltiMate3000
• 高分辨率质谱仪: AB SCIEX 5600+
实验结果展示：
蛋白酶解后的样品经过高效液相色谱的分离，质谱检测器采集数据，得到肽图结果，图谱如下：
图3 供试品的总离子流色谱图
采集的质谱原始数据，经过软件检索分析，鉴定到肽段信息与色谱峰对应关系如下表：
表1 供试品鉴定到肽段信息与色谱峰对应关系表
图4 序列覆盖图
常见问题：
问题1：哪些样品适合进行肽图分析？
回答：适合进行肽图分析的样品通常具有已知的理论参考氨基酸序列，或者存在可用作参考的样品。对于前者，我们通常使用质谱法进行HPLC质量肽图分析；对于后者，我们采用反相高效液相色谱法进行HPLC肽图分析。
问题2：肽图分析可以解决哪些问题？
回答：HPLC肽图分析可以用于解决多个问题。首先，它可以在产品放行检验的鉴别试验中评估生产工艺的批间一致性和生产用细胞基质表达的稳定性。其次，HPLC质量肽图分析可以检测和监测单个氨基酸的改变，如氧化、去酰胺化以及其他降解形式。此外，它还可以直接检测常见的生物制品修饰变异，如N端环化、C端赖氨酸处理、N-糖基化等。通过这些分析，肽图分析可帮助确定蛋白质样品的质量特征和修饰情况，进而为进一步的研究和质量控制提供指导。
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