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百泰派克

基于Edman降解的蛋白质N端测序

表达纯化后的蛋白产物,特别是蛋白品的分析过程中,需要对蛋白的末端进行验证,以保证表达纯化产物的N端和C端序列准确。Edman降解法是蛋白的N端序列分析中非常成熟的方法之一,有着广泛的应用。百泰派克公司采用岛津公司 edman测序系统,为广大科研工作者和科研客户提供纯化后蛋白产物、抗体以及蛋白疫苗的N端测序服务。采用我们的测序系统,可以测定N端30个氨基酸的序列信息。采用特定的蛋白上样系统,可以测定N端的60-70个氨基酸。百泰派克公司也建立了以先进的LC-MS/MS技术进行N-端测序的平台,可以测出封闭和修饰的蛋白质末端,与Edman降解法形成互补,保证N端测序服务的顺利进行。

在蛋白质测序前,蛋白样品首先经过SDS-PAGE的分离,保证样品的纯度满足测序的要求;随后将SDS-PAGE上的蛋白样品转移到PVDF膜上;经过染色确定把蛋白条带并切出;使用Edman测序仪对得到的PVDF膜上的蛋白样品进行分析。Edman降解测序是通过循环反应从蛋白质的N端开始逐个鉴定氨基酸的种类,从而对蛋白质的N端序列进行测定。每一个Edman测序反应包括3步:第一步是在碱性条件下,PITC与蛋白N端的游离氨基结合;第二步是在酸性溶液中,N端残基被切除;第三步是PITC结合的残基转化成为更为稳定的PTH残基,经过在线的HPLC分析,根据洗脱时间确定氨基酸种类。

this is altEdman测序反应过程


基于Edman降解的蛋白质N端测序服务流程

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Edman测序实验流程图

应用领域

蛋白表达产物的验证:重组蛋白插入位点和表达顺序是否正确
细胞株建立和发酵过程中蛋白产物的验证:验证细胞株建立和发酵过程中蛋白产物N端甲硫氨酸和信号肽是否正确处理;
蛋白降解/酶切分析:对降解/酶切形成的新蛋白片段N端进行分析,确定断裂/酶切位点;
De-novo测序:对于蛋白数据库中不存在的全新蛋白序列进行分析。

关于样品

PVDF膜类样品的准备过程

1.样品电泳和电转
a. 对蛋白样品进行1D或者2D跑胶
b. 将蛋白胶上的样品转移至PVDF膜上;注意:千万不要使用硝酸纤维素膜(Nitrocellulose membranes)
c. 在此过程中请佩戴手套和头套,避免自身角蛋白对测序结果的影响

2.PVDF膜的染色
a. 染色过程中可以使用考马斯亮蓝或者立春红对PVDF膜进行染色;注意:千万不要使用银染的方法进行染色
b. 染色完成之后,可以使用双蒸水对PVDF膜进行清洗
c. 如果转膜的缓冲液中含有甘氨酸,需要对PVDF膜进行多次冲洗,以避免甘氨酸对后续分析的影响
d. 更详细的样品准备步骤,见Edman测序样品准备Protocol

3.靶蛋白条带获取
a. PVDF膜染色后,靶条带清晰可见,用洁净的解剖刀将靶蛋白条带切下
b. 在蛋白量允许的情况下,可以准备2-3条靶条带以增加靶蛋白的量

4.样品运输
对切下的蛋白条带进行密闭包装,使用冰袋运输即可

溶液样品的准备过程

1.蛋白的纯度和用量
a. 样品需要量在1-10ug
b. 样品纯度要>90%
c. Buffer中不要使用表面活性剂,并尽可能降低溶液的盐浓度
d. Tris, glycine, guanidine, glycerol, sucrose, ethanolamine, SDS, Triton, X-100, Tween和其他的去垢剂, ammonium sulfate 和其他的铵盐均会对后续的氨基酸鉴定产生影响,在样品准备过程中要避免使用
e. 样品准备过程全程佩戴口罩和头套,避免角蛋白的影响

2.蛋白样品的运输
a. 液体样品推荐干冰运输
b. 液体样品也可以在冷冻抽干或者真空抽干后,使用冰袋运输

研究案例

如下图所示,通过Edman测序,可提供鉴定的氨基酸的详细信息。

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Edman测序研究案例

中/英文项目报告

在技术报告中,百泰派克会为您提供详细的中英文双语版技术报告,报告包括:
1. 实验步骤(中英文)
2. 相关的质谱参数(中英文)
3. 蛋白质N端测序的详细信息
4. 质谱图片
5. 原始数据

How to order?
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