Bottom-Up 方法在单细胞蛋白质组学中的挑战与机遇
Bottom‑Up 蛋白质组学，也称为“shotgun proteomics”，是将蛋白质在体外酶解成肽段，然后通过液相色谱–质谱（LC–MS/MS）鉴定多肽，再推断原始蛋白质的方法。与 top‑down 方法直接分析完整蛋白不同，bottom‑up 更适合高通量鉴定，但仅覆盖蛋白片段信息。在单细胞蛋白质组学（SCP）背景下，bottom‑up 方法需要从体积只有数皮升（pg 级）的细胞中提取足够肽段，再进行灵敏的 MS 检测，这给样本制备、分离效率、肽段覆盖度及质谱灵敏度提出严苛挑战。Bottom-Up 方法在单细胞蛋白质组学中既面临因样本极微所引发的一系列技术难题，也受益于微流控、质谱技术和数据科学的迅猛发展。未来，研究Bottom-Up 方法在单细胞蛋白质组学中的挑战与机遇是发挥Bottom‑Up 蛋白质组学重要作用的必要条件。
一、样本制备：纳升级微操作的挑战
1、微量样本的高效裂解与提取
单细胞总蛋白质量通常只有几百 pg，因此任何吸附和表面损失都可能致使检测失败
（1）微流控芯片（如 Chip‑Tip 方法）：利用 ProteoCHIP EVO 96，将单细胞在微孔中裂解、提取，并无缝对接 Evosep LC + Orbitrap Astral MS，实现高通量与高敏感度。一天可处理 ~120 个细胞，识别率可达 5000 种蛋白，有力降低技术门槛。
（2）纳升级试剂、极低体积操作：自动化液体处理平台可控制在 nL–µL，减少人为误差和样品损失。
2、多重标签与载体载体策略
类似单细胞 RNA 测序中的 index 技术，SCP 采用 TMT（Tandem Mass Tag）同位素标记，将多个细胞样品混合检测，通过 MS2 报告离子定量
载体细胞（carrier cell）策略：添加较高量的肽段样本提高 MS1 信号，提升 peptide-spectrum match 识别率。然而过量载体可能导致低丰度细胞特异肽段被稀释降低检测，需精准设计载体比例和 MS 参数。
二、分离技术：提升灵敏度与分辨率
1、液相色谱（LC）优化
纳升级 LC 在 single cell 中广泛应用，但低流速易受堵塞影响；而 Evosep One Whisper-Flow 技术优化了通量和稳定性
2、毛细管电泳–质谱（CE–MS）
CE–MS 检测灵敏度可达 1 zmol，适合分离疏水肽及 PTM 修饰肽
（1） CE 与 LC 职能互补，可实现更广泛的肽段覆盖。
（2）尤其适合对翻译后修饰（如磷酸化、糖基化）进行高灵敏度分析。
3、离子迁移（Ion Mobility）分离
（1）4D‑DIA 技术在 LC–MS/MS 基础上加入离子迁移维度（ion mobility），提高多肽分辨率与 MS2 可信度
（2）DIA 方法比DDA 更全面、缺失值更少，是单细胞多肽采集的关键策略
三、质谱检测：灵敏度 vs. 通量
1、仪器发展的双重趋势
（1）Orbitrap Astral 与 timsTOF PASEF 等新型质谱仪提升 ms1 MS2 捕获率和准确度；
（2）通过优化仪器扫描模式，最终实现单细胞中千蛋白水平定量
2、DDA vs. DIA：缺失模式与全谱模式
（1）DDA：选择性碎片化易遗漏低丰度多肽，单细胞中因信号稀薄，随机性更强 。
（2）DIA：扫描全质量范围，减少随机性，适合高通量单细胞检测，配合机器学习提升肽段解读
四、数据分析：识别率、缺失值、定量误差
1、肽段识别算法的适配
单细胞样本缩小厚度导致碎片谱图更复杂，常见数据库查重和假阳性率上升 。
（1）需激活更低的 FDR 阈值，并借助 open-search、深度学习谱图识别算法，如 Spectronaut、DIA-NN。
2、缺失值与归一化策略
由于低丰度多肽经常检测不到，造成空值频发。
（1）引入载体细胞：提高 MS1 信号；
（2）使用多重 imputation 方法：如 KNN、Low rank、MLE，实现数据完整性。
（3）algorithmic normalization，如 LOESS、vsn 标准化，缓解批次效应对定量的偏差。
3、统计显著性与多组比较
单细胞研究通常涉及 10³–10⁴ 个细胞，组间差异统计需采用单细胞特有算法，如 MAST、SCDE，结合蛋白丰度变化探测。SCP 工具推荐实践如 Gatto 等的社区建议
五、挑战综述与未来机遇
1、挑战一：动态范围与低丰度蛋白
单细胞蛋白丰度跨度超过 10^5–10^7 级别，低丰度信号极易被噪音掩盖 。未来可结合 top‑down 或 middle‑down 分析，增加 PTM 和蛋白同种型信息。
2、挑战二：通量 vs. 灵敏度的权衡
高通量要求细胞处理自动化；灵敏度需长 LC 流程。最优策略是结合 Evosep 电动样本载入 + timsTOF 快速扫描 + DIA 方法，实现平衡。
3、挑战三：标准化与可重复性
目前方法多样，缺乏统一 SOP 和 QC 指标，可结合 SCP 跟踪 PTM 调控机制，并整合 AI 模型预测功能。
Bottom‑Up 方法在单细胞蛋白质组学中既面对灵敏度、准确度与样本损失的挑战，也拥有高通量、低成本与平台兼容性的独特机遇。随着仪器性能、自动化和 AI 数据处理的进步，SCP 正处于类似单细胞 RNA-seq 早期时代的“爆发前夜” 。在这个变革期，百泰派克生物科技面对行业前沿，梯度排列技术储备与定量策略，为科研机构和生命科学企业提供 “从单细胞到临床应用” 的全流程 bottom‑up SCP 解决方案。期待与各方合作，共同迈入单细胞蛋白质新纪元！
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