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iTRAQ/TMT标签结构以及相对定量原理详解

导读
• iTRAQ/TMT定量蛋白组学技术
• iTRAQ/TMT标签分子组成
• iTRAQ/TMT技术原理

iTRAQ和TMT标签介绍

说到iTRAQ和TMT很多人可能会以为这是两中不同的定量组学技术,但其实呢,iTRAQ和TMT技术只是生产商不同,除了标记规格和标签分子结构有些许差异,标记肽段的原理基本上是一样的。其中iTRAQ由AB SCIEX所开发,紧接着Thermo Fisher研发了TMT,二者只是专利不同,但是使用原理基本一致。

iTRAQ:Isobaric Tag for Relative and Absolute Quantitation
TMT:Tandem Mass Tag

TRAQ和TMT标记实质上就是一种化学体外标记试剂,能够特异性标记蛋白质酶解产生的多肽,并同时定量分析多组蛋白样品

iTRAQ和TMT标记实质上就是一种化学体外标记试剂,能够特异性标记蛋白质酶解产生的多肽。iTRAQ和TMT标记的蛋白样品规格不同,相比之下TMT能够标记更广泛的样品数,能够同时定量分析多组蛋白样品,少至2个蛋白样品,多至10个蛋白样品,TMT蛋白定量都能够做到。通过标记多组不同样品,TMT和iTRAQ能够同时比对正常组织样品和肿瘤组织样品的蛋白水平差异,以及精准检测肿瘤在发展的不同阶段的蛋白水平变化。

虽然iTRAQ和TMT的标记原理一样,但是两种标签的结构却有一些差异,接下来我们来看看ITRAQ和TMT的标签结构一个各自的细微差异吧

iTRAQ与TMT的分子结构比较

TRAQ和TMT标记实质上就是一种化学体外标记试剂,能够特异性标记蛋白质酶解产生的多肽,并同时定量分析多组蛋白样品。iTRAQ与TMT的分子结构比较

从上图来说,我们可以看到iTRAQ和TMT标签在结构上有着明显的差异,但是也有着一些共同点,首先两个标签都由报告基团,平衡基团以及肽反应基团组成,两个标签的各自报告基团和平衡基团的总重都是一定的。另外,两个标签的肽反应基结构也是一样的。iTRAQ和TMT标签的差异在于平衡基团的结构,从下图可以看到TMT的平衡基团结构比iTRAQ标签的更为复杂。iTRAQ标签的平衡基团只有几十Da,而TMT的平衡基团接近200Da,这也是造成iTRAQ和TMT标签质量差异的原因。

简单介绍完两个标签的结构后,我们再以iTRAQ 4-plex标签为例,详细认识一下iTRAQ分子标签的结构组成

iTRAQ分子结构组成

iTRAQ和TMT标记实质上就是一种化学体外标记试剂,能够特异性标记蛋白质酶解产生的多肽,并同时定量分析多组蛋白样品。iTRAQ 4-plex标签结构

iTRAQ标签分子骨架由三部分核心组件构成:报告基团,平衡基团和肽反应基团。其中,报告基团和平衡基团构成等基团。不同的iTRAQ标签的报告基团的重量不同,4-plex标签的报告基团重量分别是:114,115,116,117Da;平衡基团的质量分别是:31,30,29,28Da,使得4个iTRAQ标签的报告基团总重都是145Da。另外一个核心组件就是肽反应基团,其主要的功能就是与多肽游离的N端氨基发生置换反应,使同位素标签共价交连到肽段N端。 前面说到标签报告基团和平衡基团的质量,很多人可能会好奇,标签的报告基团仅仅相差几个Da,这是如何做到的呢?其实这就是利用了同位素标记的原理。下面我们以iTRAQ标签为例进行解释。

如下图,质量为114的报告基团包含1个C13,报告基团质量增加1Da。同时平衡基团包含1个C13和1个O18,质量总共增加3Da,因此,114标签的总质量增加4Da。以此类推,115的报告基团增加2Da,平衡基团增加2Da;116的报告基团增加3Da,平衡基团增加1Da;117的报告基团增加4Da,平衡基团增加0Da。以上四个标签通过对报告基团和平衡基团进行不同的同位素标记后,各自的报告基团和平衡基团的增加质量不同,但是增加的总的质量是一样的,因此,标签的总重相等。

iTRAQ和TMT标记实质上就是一种化学体外标记试剂,能够特异性标记蛋白质酶解产生的多肽,并同时定量分析多组蛋白样品。iTRAQ标签的同位素标记

标签与肽段反应的过程

iTRAQ和TMT标记实质上就是一种化学体外标记试剂,能够特异性标记蛋白质酶解产生的多肽,并同时定量分析多组蛋白样品.肽段标记反应过程

iTRAQ相对定量研究原理

蛋白质首先被裂解为肽段,然后用iTRAQ试剂进行差异标记。由于iTRAQ试剂是等量的,即不同同位素在标记同一多肽后在第一级质谱检测,分子量完全相同,用串联质谱方法对在第一级质谱检测到前体离子进行碰撞诱导解离,产物离子通过第二级质谱进行分析。在二级质谱分析过程中,报告基团、质量平衡基团和多肽反应基团之间的键断裂,质量平衡基团丢失,产生低质荷比(m/z)的报告离子。由于二级质谱可分析相对分子质量相差1的报告基团,不同报告基团离子强度的差异就代表了它所标记的多肽的相对丰度。同时,多肽内的酰胺键断裂,形成一系列 b 离子和 y 离子,得到离子片段的质量数,通过数据库查询和比较,可以鉴定出相应的蛋白质前体。

TRAQ和TMT标记实质上就是一种化学体外标记试剂,能够特异性标记蛋白质酶解产生的多肽,并同时定量分析多组蛋白样品。
iTRAQ定量分析原理


iTRAQ相对定量研究流程

iTRAQ和TMT标记实质上就是一种化学体外标记试剂,能够特异性标记蛋白质酶解产生的多肽,并同时定量分析多组蛋白样品。iTRAQ定量分析流程

1. 对不同的蛋白质样品进行酶切消化成多肽片段
2. 使用不同的iTRAQ标签对不同蛋白样品消化产生的多肽片段分别进行标记,但是不同的iTRAQ标签的总质量是一样的。
3. 比例混合各个标记后的样品
4. 带上标记的多肽片段经过一级质谱分离,在一级质谱中,iTRAQ标签由于总质量数一样,来自不同蛋白样品的相同肽段不能被区分,因此会一起进入二级质谱分析
5. 在二级质谱中,在高能碰撞下iTRAQ的平衡基团会被打碎,因此报告基团得到释放,同时肽段也被释放,碰撞碎裂成二级碎片。这时通过分析肽段的氨基酸序列,可以推测对应的蛋白质的序列;同时各个报告基团的在质谱中的信号强度代表多肽在4组样品中的相对丰度,即反应相应的蛋白质在4组样品中的相对表达水平。


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