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蛋白质测序常见问题汇总(一)

蛋白质研究常常涉及到蛋白质鉴定以及对蛋白质的序列研究,而刚接触蛋白测序方面的新手往往会遇到各种各样的问题,在这期小编给大家贴心汇总了有关蛋白质测序大家比较关心的一些问题,希望对大家了解蛋白质测序能有些许帮助。

1. 蛋白质测序和核酸测序的思路有什么不同?

蛋白质无论Edman测序还是质谱测序法都是通过化学反应或者高能碰撞破碎共价键对氨基酸残基序列进行分析,因而会对蛋白质的化学键进行破坏。而核酸测序是利用DNA复制原理,使用DNA酶重新合成新链,母链不受破坏,在这个过程中,随机中断新链的合成,研究新链合成吸收的核苷酸即可推测出对应母链的序列。

2. 蛋白质测序对蛋白质的活性有要求吗?

蛋白质测序是不需要保持蛋白质的活性的,因为不需要研究蛋白质的功能。目前可以选用的蛋白质测序方法有Edman降解测序和质谱测序法。Edman测序法对蛋白的纯度要求较高,只需要几微克蛋白就足够测序。Edman测序法只能够对蛋白N端进行测序,因为Edman测序是基于降解蛋白质N端的氨基酸,再对其进行鉴定,通常Edman能够鉴定蛋白质N端大概50个氨基酸,可以达到70个氨基酸。质谱鉴定的范围更广,能够鉴定的蛋白数量更多,但是质谱鉴定往往需要基于数据库比对进行鉴定,因此对于数据库不包含的蛋白质,质谱鉴定不能准确分析这类蛋白质的序列。

3. SDS胶上的条带可不可以切割下来送质谱测序?

可以,SDS分离的蛋白条带可以直接切下来送质谱鉴定,为了提升鉴定的精准度,跑胶的时候需要选用适合胶浓度用于分离目的蛋白条带,并尽量将目的蛋白附近的蛋白条带跑开一些。

4. SDS蛋白条带太细了,也能够鉴定蛋白吗?

一般来说,对于考马斯和SYPRO Ruby染色的蛋白质条带,肉眼可见的蛋白条带对于测序来说就已足够。

5. 切下来的SDS蛋白条带可能含有不止一条蛋白条带怎么办?

如果切下的蛋白条带含有多个蛋白条带也可以进行蛋白鉴定分析,再通过数据比对推测蛋白序列。其实多数SDS-PAGE胶分离后切下的蛋白条带中都含有多个蛋白,鉴定这些复杂蛋白可以通过色谱质谱串联鉴定法,先通过色谱将复杂蛋白分组分,再通过质谱对一个个组分进行分析,可以达到较高的精度。

6. Western blot的结果可不可以做蛋白测序?

Western blot转膜后的蛋白质是可以进行蛋白测序的。可以根据western blotting结果对照SDS-PAGE胶,找出SDS-PAGE胶上相应蛋白条带的位置,再把蛋白胶条切下来进行质谱鉴定。如果蛋白量足够大,纯度足够高的话,可以直接将PVDF膜上的蛋白条带切下来进行N端测序鉴定。

7. 蛋白质样品准备过程中需要注意哪些事项?

利用质谱进行蛋白样品的鉴定的灵敏度较高,在操作过程中引入的微量外来污染蛋白也极有可能被质谱鉴定出来,这会对蛋白测序结果分析的准确度造成很大的影响。因此,在准备质谱分析样品准备过程中,需使用干净无污染的器皿,使用纯度达到质谱鉴定水平的试剂,使用到的溶液需要进行新鲜配制,并且佩戴手套和头套,避免自身角蛋白(keratin)对样品的污染。

8. 蛋白测序各类样品的制备有什么要求?

通常情况下,对于SDS-PAGE胶分离的蛋白样品来说,考马斯和SYPRO Ruby染色的蛋白质条带都能与质谱鉴定很好的兼容。但是对于银染的蛋白质一定不能使用戊二醛作为固定剂,这会影响到接下来的质谱分析。另外,蛋白质干粉和蛋白质也都能够进行样品测序。如果蛋白质溶液的浓度较低,在样品准备过程中则需要尽量减少SDS等表面活性剂的使用,并注意降低盐浓度,这样可以相应提升蛋白质鉴定的精准度。

9. 想要进行测序的蛋白质分子量较小,如何进行蛋白样品制备?

如果研究的蛋白分子量比较小,可以使用浓度较高的SDS-PAGE胶将蛋白质进行分离,然后对蛋白胶进行考马斯染色,再将与目的蛋白大小一致的蛋白条带切割下来,切下来的蛋白胶条可以送质谱鉴定。

10. 样品寄送有什么要求?

蛋白质条带和干粉比较稳定,可以选用冰袋包装进行运送。蛋白质溶液则需要使用干冰寄送,我们推荐您将样品冻干后进行运输,冻干样品中蛋白非常稳定。冰冻样品需要尽量避免蛋白样品反复冻融,以免造成蛋白降解。

11. 为什么在进行质谱测序前需要对蛋白质进行酶切消化成多肽片段?

蛋白消化蛋白的基团越大,质谱检测的准确率越低。因此,在质谱检测之前,须将蛋白消化成小分子的多肽,以提高质谱检测的准确率。一般而言,6- 20 个氨基酸的多肽适合质谱仪的检测。

12. 如何提升蛋白质测序中修饰肽段序列的测定效率?

在目前条件下,质谱很难100%给出肽段的序列,经常会丢失一些肽段,蛋白质磷酸化修饰也会抑制胰蛋白酶的酶解,并且磷酸化肽的含量较非磷酸化肽段的含量少很多,质谱对质谱分析仪磷酸化肽的响应就可能会被抑制。因此,要尽可能把非磷酸化肽段的含量降到。减少非磷酸化肽的方法有分馏、IMAC(固相化金属亲和色谱)和抗体结合。通过MALDI-TOF-MS测定肽段的分子量,根据所得肽段分子量比预计的分子量大80Da或其整倍数,判定是否存在磷酸化修饰。

13. 蛋白质N-端氨基酸序列的测定结果中有两个残基同时发生了两种氨基酸的Edman降解。可能引起这种结果的原因有哪些呢?

Edman降解反应中检测出两个氨基酸残基,有可能性是蛋白不纯,有杂蛋白污染,如果其中一个氨基酸是甘氨酸的话,有可能是蛋白条带中残余的buffer里的甘氨酸未完全去除导致的。


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