蛋白磷酸化鉴定技术介绍

蛋白质表达以后，在发挥真正功能之前，会经过多种不同的翻译后修饰，例如，磷酸化，乙酰化，糖基化等基团修饰。本文主要讲下两种研究蛋白磷酸化修饰的方法：Western Blot和质谱检测法。




蛋白质翻译后修饰种类

蛋白磷酸化修饰过程
蛋白磷酸化修饰这一过程是通过蛋白激酶催化，将磷酸基团从ATP转移到多肽底物的丝氨酸、苏氨酸，或酪氨酸残基上。并且磷酸化修饰的过程是可逆的，去磷酸化反应由蛋白磷酸酶催化完成。




蛋白质磷酸化修饰反应过程

蛋白磷酸化检测方法
目前，蛋白磷酸化的检测方法有很多种，本文将着重讲解两种检测蛋白磷酸化的方法：Western Blot和质谱分析法。

一 、Western Blot检测方法
Western Blot是检测蛋白磷酸化水平的常用方法，主要过程为先利用SDS-PAGE分离蛋白质，随后将蛋白质转移到PVDF膜上，然后使用特异性识别磷酸化蛋白的抗体来鉴定目标蛋白的磷酸化水平。只有被磷酸化修饰的蛋白才会在相应分子质量的地方显现特异性蛋白条带。




Western Blot实验过程



Western Blot蛋白磷酸化检测结果

Western Blot检测方法优势：
1. WB方法简便，多数实验室具备Western Blot设备条件。
2. 许多磷酸化抗体十分灵敏，能够检测低至10ug的蛋白样品。
3. 对于丰度低的蛋白，可以先通过IP使用目标蛋白的抗体对目标蛋白进行富集，再进行WB检测被磷酸化的蛋白，检测效率可以提高几倍甚至几十倍。

Western Blot检测方法缺点：
1. 特异性磷酸化抗体难以制备，许多特异性位点的磷酸化检测受限。
2. 测定的磷酸化水平受样品处理和凝胶上样的误差影响。
3. 同时获取多个蛋白质磷酸化的位点信息会受限。

二、质谱检测方法
Western Blot的方法虽然简便，但是对于大规模分析复杂的生物样品的磷酸化水平就不再适用了。而质谱却能很好的解决这一问题。依靠高精准度质谱仪，如今快速准确分析细胞中高丰度蛋白的磷酸化修饰已是非常简单的事。具体的检测方法为先通过SDS-PAGE胶，或者2D-PAGE胶等分离目标蛋白，将含有目标蛋白的条带切下，胰酶消化，LC-MS/MS检测分析蛋白序列和相应位点的磷酸化修饰。这个方法适用于同时检测多个目标蛋白的磷酸化水平。此外，对于磷酸化丰度相对较低的目标蛋白，我们也能采取像下图中固定化金属亲和层析IMAC等方法来富集磷酸化的肽段，再使用质谱对富集的蛋白进行分析。




磷酸化蛋白富集和质谱检测


质谱检测方法优势：
1. 精准度高，能够同时检测多个蛋白的多个磷酸化位点。
2. 适用于大规模分析蛋白磷酸化水平。
3. 不依赖于磷酸化抗体。

质谱检测方法缺点：
1. 设备要求较高，通常需要借助专业质谱分析机构。
2. 测序结果分析相对复杂，需要依赖专业分析软件，以及生物信息技术平台。

在实际应用中，Western Blot与质谱分析方法各有各的好，谁也无法完全被另一种方法所替代。所以在选择测定磷酸化修饰的时候还应该根据具体需要来决定。如果研究的蛋白正好有商业化的磷酸化抗体，那么lucky you，你可以选择Western Blot进行快速磷酸化测定研究。但是如果你所研究的蛋白质没有可用的商业化磷酸抗体，或是抗体价效过低，亦或是需要大规模地检测细胞内磷酸化蛋白的水平的话，质谱检测会是更好地选择。