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蛋白质质谱鉴定前样品制备注意事项

随着高分辨率质谱仪分析技术的发展,蛋白质质谱鉴定的方法已经相当纯熟,一次性鉴定多个蛋白样品,以及低丰度蛋白样品已经不再是难事。但是因为质谱的灵敏度高,外来引入的蛋白质可能会造成质谱鉴定的假阳性,因此,在蛋白样品的准备过程中要注意避免引入外来蛋白污染物。另外,蛋白样品的准备也需要使用与质谱仪检测兼容的溶液和试剂,这样可以极大提高质谱仪鉴定的准确度。在这期小编就来给大家介绍蛋白质质谱鉴定前的样品准备注意事项。

1. 蛋白质样品制备和质谱鉴定流程

随着高分辨率质谱仪分析技术的发展,蛋白质质谱鉴定的方法已经相当纯熟,一次性鉴定多个蛋白样品,以及低丰度蛋白样品已经不再是难事。这期文章我们讲讲蛋白质质谱鉴定前样品制备注意事项蛋白质质谱分析一般流程

蛋白质质谱鉴定的一般流程

1. 首先对细胞或组织样品进行破碎,破碎的方法有很多种。大多数细胞可以通过选用常用的细胞裂解试剂,例如RIPA buffer,添加蛋白酶抑制剂和还原剂,来裂解细胞。组织则可以通过低温匀浆,液氮冷冻研磨等方法破碎组织细胞。
2. 接着12,000 rpm,4度高速离心10分钟,去除不可溶的细胞组分
3. 液体蛋白样品可以使用抗体进行富集,提纯,以及IP处理,再浓缩待检测的蛋白;也可以使用1D/2D-PAGE gel分离蛋白。
4. 浓缩后的液体蛋白经过酶切后,再使用LC-MS/MS分析;蛋白胶样则需要切下与目的蛋白分子量一致的蛋白条带,再对蛋白进行in-gel酶切和质谱检测分析。
5. 对质谱鉴定的数据进行分析获得可信度高的蛋白肽段序列,再与蛋白数据库进行比对获得蛋白质ID

2. 样品类型

细胞样品:动物细胞,植物细胞,真菌和细菌等微生物细胞
组织样品:动物组织,植物组织
体液样品:血清、血浆、尿液等

3. 样品用量

4. 注意事项

4.1. 浓缩样品:
蛋白质样品可以用沉淀,膜分离,分离柱,冷冻干燥等各种方式进行浓缩, 用户应根据样品的特点选择合适的方法共列,用SDS样品液可以从色谱样上中洗脱蛋白,从而保持样本体积小。

4.2. 电泳凝胶:
对于SDS- PAGE,传统的Laemmli式,三甘氨酸凝胶及其各种改进型的凝胶,如二,三凝胶或三盐酸凝胶, 都可以兼容于蛋白质鉴定。各种凝胶浓度也没有限制。用户选择凝胶的类型和浓度液,应根据对样本的分离效果好来决定。

4.3. 蛋白胶染色:
• Coomassie Blue, SYPRO Ruby 以及Silver stain样品均可进行蛋白的鉴定试验;
• 银染的样品有可能与后续的质谱分析不兼容,我们推荐您使用下面的产品或者实验步骤进行银染实验:
ProteoSilver Plus, Sigma (Product # PROTSIL1 or PROTSIL2)
Dodeca Silver Stain, BioRad (Product # 161-0481 or 161-0480)
• 另外,银染的样品请不要进行脱色处理

4.4. 液体样品:
样品准备过程中尽量减少SDS等表面活性剂的使用,并注意降低盐浓度。如果您提交IP洗脱样品,我们推荐使用HPH EB (0.5 M NH4OH, 0.5 mM EDTA) 缓冲体系进行last step蛋白的洗脱,保证洗脱缓冲体系与后续的质谱实验兼容。

4.5. 切割蛋白带:
凝胶在切割过程中应避免与手,灯箱, 或任何其他可能的角蛋白污染源直接接触。在切割蛋白胶带适应尽量避免割下空白凝胶(它可能会降低酶切的消化效率和多肽的回收率)。 将每个凝胶带置于干净的,1.5毫升的微型离心管并给每个样本小心地做上标签。


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