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项目文章 | 一种新的多糖裂合酶家族10果胶酸裂合酶的筛选:克隆、表达和鉴定

2018年10月,济南大学高娟课题组在Molecules杂志上发表了题为“Screening of a Novel Polysaccharide Lyase Family 10 Pectate Lyase from Paenibacillus polymyxa KF-1: Cloning, Expression and Characterization”的研究性文章,该研究从多粘芽孢杆菌KF-1中筛选出了一个新的属于多糖裂合酶家族10(PL10)的果胶酸裂合酶。

研究发现,经果胶酸裂合酶PpPel10a处理的苎麻纤维的重量损失显著,表明该酶在苎麻脱胶中的应用潜力,且PpPel10a具有良好的热稳定性和pH稳定性,表明该酶可能适用于纺织工业。该项研究中,百泰派克生物科技提供了基于nanoLC-MS/MS的蛋白质谱分析服务,对酶反应复合物进行蛋白质谱鉴定。nanoLC-MS/MS质谱分析结合CAZy数据库(www.cazy.org)搜库,检索到分属于4个果胶酶家族的10个多肽片段,分别属于PL家族1、3、9和10。

molecules

研究背景

苎麻纤维具有广泛的应用潜力,可用于制造服装面料、麻绳和帆布等,但其表面覆盖有一种胶样物质,限制了它在纺织工业中的应用。传统的脱胶工艺采用碱性高温处理,会对纤维造成损害且污染环境。有研究表明,脱胶过程可以通过果胶酸裂合酶的酶催化来实现,与碱性脱胶相比酶法脱胶具有效率高、条件温和、对环境友好等优点。果胶酸裂合酶(EC 4.2.2.2)是催化果胶酸裂解产生寡糖的酶。之前还没有研究多糖裂合酶家族10(PL10)的酶在苎麻脱胶中的应用。

研究概述

本研究中,研究者从多粘类芽孢杆菌KF-1分泌的酶提取物中筛选出一种新的PL10果胶酸裂合酶,并通过LC-MS/MS进行了蛋白质谱鉴定。基因克隆自KF-1的基因组DNA,并在大肠杆菌中表达。重组酶PpPel10a的预测Mr值为45.2 kDa,pI值为9.41。以聚半乳糖醛酸(PGA)为底物,确定了PpPel10a的最佳反应条件为50 ℃,pH 9.0。以PGA为底物的PpPel10a的Km、vmax和kcat值分别为0.12 g/L,289 μmol/min/mg和202.3 s-1。重组PpPel10a可降解柑橘果胶,产生不饱和单半乳糖醛酸和寡半乳糖醛酸。PpPel10a降低了PGA的粘度,且观察到单PpPel10a或PpPel10a与碱结合处理后,苎麻纤维的重量分别减轻了22.5%和26.3%,如图1.D,E。据报道,苎麻纤维的总胶质含量约为30-34%,表明PpPel10有应用于植物纤维加工的潜力。

处理后的苎麻纤维
图1. 处理后的苎麻纤维
(图片来自原文献,版权属于原作者)

研究中,研究者首先确定了多粘类芽孢杆菌具有果胶降解活性,因此分离了其果胶酸裂合酶活性最高的组分,进行了nanoLC-MS/MS蛋白质谱分析,该服务由我司百泰派克生物科技提供。通过nanoLC-MS/MS质谱分析,一共鉴定到28个蛋白质,包括4个果胶酸裂合酶,1个果胶酯酶和23个非果胶降解酶。10个多肽片段搜库结果分属于四个果胶酸裂合酶家族,分别属于PL家族1,3,9和10,如表1所示,其中属于PL10家族的在LC-MS/MS分析中显示出最高强度。这些结果为研究后期PL10果胶裂合酶的克隆、表达和功能鉴定提供了基础。

多粘类芽孢杆菌KF-1中的果胶酸裂合酶
表1.LC-MS/MS分析鉴定多粘类芽孢杆菌KF-1中的果胶酸裂合酶
(表格来自原文献,版权属于原作者)

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