Preclinical
SEARCH
Home > 关于我们 > Blog > 科普干货 > Edman测序原理以及影响因素总结
Edman测序原理以及影响因素总结

Edman降解的化学原理
1. 偶联:异硫氰酸苯酯(PITC)与蛋白质/多肽的N端α残基反应。
2. 环化裂解:苯氨基硫甲酰酞(PTC-肽)环化裂解
3. 转化:噻唑呤酮苯胺(ATZ)转化为苯异硫尿氨基酸(PTH-氨基酸)

Edman降解法作为现有蛋白质样品N端序列测试的黄金标准,已得到广泛应用。但是在实际应用中,Edman降解法也有一定的局限。本文总结Edman降解测序原理和步骤,以及详细说明影响Edman降解测序的因素。Edman降解的化学原理

Edman测序仪的基本操作步骤

1. 首先打开高纯氩气阀使分压为0.5mp,然后依次开泵,检测器和测序仪主机开关,等待检测器自动检测完毕后,开计算机。
2. 打开计算机操作软件到主菜单控制界面,按照操作指南准备测序前工作,如各种试剂和PTH-氨基酸配制装载,HPLC系统洗脱液的准备等,注意每次测序前一定要仔细观察每种试剂和洗脱液能够保证此次测序能够顺利完成。
3. 样品测序仪反应室前的预处理,首先在反应室上部玻璃块加上新的玻璃纤维滤膜片,加Biobrene,干燥后上机进行预循环。在经过预循环的玻璃纤维膜片上加入蛋白样品,样品干燥后,再在其上面覆盖一微孔聚四氟乙烯(teflon)滤膜,将上下两个玻璃柱体倒置后装入反应夹套中固定。
4. 在计算机上编制本次测序的程序。如样品名,选择循环方法,设定循环数目,标准氨基酸和样品进样量等。
5. 将HPLC系统调整到优化状态,预先做一标准氨基酸循环,检查所有PTH-氨基酸时候得到基线分离。
6. 测序完毕,关机。
7. 分析HPLC图谱数据,与标准HPLC图谱进行对比,从而对氨基酸进行鉴定。

Edman测序分析PTH-氨基酸的原理

总的来说,在每个测序循环中,首先先由Edman测序仪分离的PTH-氨基酸,接着使用HPLC分别测定PTH-氨基酸图谱,再与20中氨基酸的标准HPLC图谱,从而得到对应的氨基酸的信息。下图中显示了20个氨基酸的标准HPLC图谱。

Edman测序仪标准PTH-氨基酸HPLC图谱

蛋白质N端封闭案例

Edman降解法作为现有蛋白质样品N端序列测试的黄金标准,已得到广泛应用。但是在实际应用中,Edman降解法也有一定的局限。例如,我们有一位客户送来样品,想要对一个的在芽孢杆菌中表达的重组蛋白的N端进行测序。然而我们将样品转移到PVDF膜上之后测序过程中没有任何信号,并且重复的依然如此,根据我们的经验我们推测重组表达蛋白可能发生了N-末端封闭。

那么什么是蛋白N端封闭呢?

蛋白质的N端在未封闭的情况下具有自由的α氨基,PITC与α氨基反应是Edman降解测序反应的第一步。当蛋白质N端发生封闭时,N端的α氨基被修饰使得N端缺乏自由的α氨基,导致PITC实际无法与蛋白质结合,使得Edman降解反应无法进行下去。其实在自然界中,50%的天然蛋白质N端都经过了修饰,常见的修饰包括乙酰化、甲基化、焦谷氨酸化等。另外,有时在蛋白样品的分离提纯过程中也有可能产生N端封闭修饰,这个主要是由于溶液中的去垢剂或化学物质与蛋白样品N端功能基团反应,或者分离提纯使用的溶剂的pH值过高导致的。

由于目前Edman降解法用于蛋白质N端封闭的情况是无法进行测序的。在这种情况下可以通过蛋白酶切成多肽片段再使用液相色谱与质谱联用的方法进行序列测定,如果造成蛋白质N封闭的修饰是已知的,可以使用相对应的蛋白酶切除N端的修饰,接着就可以使用Edman降解反应进行测序。例如,许多抗体类药物的N端存在焦谷氨酸环化封闭,当使用焦谷氨肽酶酶解后,就可以直接使用Edman降解法对抗体进行测序工作。

影响Edman降解结果的因素

1. 测序使用的化学试剂如果纯度不够高,也有可能在PTH色谱中产生假峰,从而影响对氨基酸序列的准确判定。
2. 由于各种氨基酸残基化学或物理性质不同,因此判断其含量时PTH信号的强弱会发生变化。例如,酪氨酸和丝氨酸容易发生脱羟基造成峰值发生变化,当半胱氨酸发生修饰时很难检测到信号,组氨酸和精氨酸由于极性难以被萃取,甲硫氨酸容易被氧化,这些因素都会导致峰值相应较低。
3. 带有修饰残基在检测时表现出与其他未修饰氨基酸相似的峰也会造成氨基酸识别错误。


百泰派克微信公众号二维码
百泰派克定位图标 地址:
北京市朝阳区北新桥三条
百泰派克邮箱图标 邮箱:
info@biotech-pack.com
百泰派克电话图标 电话:
010-57231915
152-0137-7680