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Edman测序原理概念总结

本文主要介绍Edman降解测序的三个问题,那就是Edman降解测序究竟是门什么技术?我为什么要使用Edman测序?什么情况下不能使用这项技术?因此,对于对Edman测序技术陌生又着急能够尽快读懂Edman测序技术的科研小白,你们来对地方啦!

什么是Edman降解测序?

一句话简单通俗地说就是Edman降解测序是通过化学反应依次切下蛋白质N端的每一个氨基酸,再使用HPLC液相色谱分别鉴定氨基酸的ID,得到的氨基酸信息排序结果即为蛋白质N端的序列。接下俩,我们用测定蛋白质N端的第一个氨基酸为例来解释一下单个Edman测序反应的整个过程是怎样的.

Edman降解法测定蛋白质N端首位氨基酸的流程

本文主要直击有关Edman降解测序的三个问题,那就是Edman降解测序究竟是门什么技术?我为什么要使用Edman测序?什么情况下不能使用这项技术?帮助科研小白尽快读懂Edman测序技术。Edman降解法测定N端首位氨基酸的流程介绍

首先,蛋白质N端的a氨基与PITC发生偶联作用,偶联反应的结果就是PITC被连接到蛋白质的N端。接着用三氯乙酸(TFA)处理PITC-蛋白复合物,在三氯乙酸的作用下,PITC和它连接第一个氨基酸可以被特异地切割下来,形成PITC-氨基酸复合物。紧接着这个PITC-氨基酸被萃取分离出来。随后PITC-氨基酸被转成更为稳定的PTH-氨基酸形体。PTH-氨基酸经由HPLC色谱鉴定出色谱图,再与标准的氨基酸色谱图进行比较,从而获得首位氨基酸的信息。同理,按照这个方法依次测定余下的氨基酸序列,即可获得蛋白质N端的氨基酸序列信息。

什么情况下使用Edman测序?

根据Edman测序的原理,我们可以知道Edman测序的起始点是从蛋白质N端的a游离氨基开始的,再依按从N端到C的方向依次测定氨基酸序列的。因此,不难理解Edman测序可以应用于多种蛋白质N端序列测定,包括重组蛋白、蛋白亚型、抗体、多肽等。

Edman测序法相比传统质谱法的优势

Edman测序法可以直接分析氨基酸信息,并且不需要借助任何蛋白质数据库,因此,Edman测序可以对全新的没有数据库信息的蛋白质进行N端序列分析。而传统的质谱测序法则需要借助已知的蛋白数据库,将测定的多肽序列与蛋白数据库进行比对,再对蛋白的ID和序列进行推测,所以,传统质谱法不能对数据库中不包含的蛋白质进行测序。另外,质谱法也不能够准确区分分子量相近的氨基酸(I/L、Q/K),以及蛋白质上的突变位点。Edman测序对于N端突变/改造蛋白的测序可以提供直接测序测定,并且更为准确。这也是为什么即使Edman测序至今仍被称为蛋白质N端序列分析的黄金标准。

Edman测序的局限性

Edman测序主要的有几个局限性:通量较低,无法对多个蛋白质进行同时分析,分析过程也相对耗时,对每个残基测试需花费45分钟时间,且每个残基测试的费用成本较高。另外,由于Edman测序的起始点是从蛋白质N端的游离的a氨基开始,因此对于N端封闭(a氨基具有乙酰化、甲基化、焦谷氨酸化等修饰)这一类不具有游离的a氨基的蛋白质,Edman降解测序的反应是无法进行的,因此也就无法对这类样品直接进行N端测序。

由于Edman一般对蛋白质N端50个左右氨基酸序列进行测定,对于分析蛋白质全长序列具有一定的局限性。但是使用Edman测序法对蛋白全长序列进行分析也是可以实现的,只需要将蛋白质酶切成多个短肽,再利用Edman测序法分析各个短肽的序列,就可以拼接成蛋白全长序列。

说到这里,您肯定想问小编既然Edman测序对于蛋白N端测序有很高的精准度,那么有没有针对解决这些Edman的局限性的方法呢?答案是有的,针对通量的问题,我们可以结合质谱鉴定和Edman测序的优势,实现高通量的蛋白鉴定和精准序列测定。另外,对于N端封闭的情况,可以根据具体情况选择相应的酶去除蛋白N端的修饰,或者使用质谱鉴定的方法鉴定N端的修饰。针对Edman测序和质谱测序两种方法的有缺点,在蛋白质样品N端测序过程中相互相互补充,取长补短。


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