蛋白质测序常见问题汇总（二）

上期给大家汇总了一些有关蛋白质测序原理的基础知识，这期着重给大家列举一些蛋白质测序实验中新手可能想问的问题，希望对网接触蛋白质测序的实验新手在选择蛋白质测序方法上有指导性帮助。

1. 蛋白质样品纯度较高，有什么快速的蛋白质测序的方法吗？

可以通过鉴定蛋白质的肽谱图（Peptide mass fingerprinting，PMF）达到快速测定蛋白质测序的目的。因为每个蛋白质的序列是特异的，经过特定酶切产生的多肽的质量也是一定的，因此，可以利用这一特性，通过测定蛋白质酶切后产生的多肽的质量图谱，即测定蛋白质肽谱图，再与数据库蛋白质酶切的理论肽谱图进行比对，从而推断出蛋白质的序列。

2. 蛋白质肽谱图鉴定是基于哪项质谱技术？

测定肽混合物质量数有效的质谱仪是MALDI-TOF-MS（基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱，英文名Matrix-Assisted Laser Desorption/ Ionization Time of Flight Mass Spectrometry），灵敏度高，谱峰简单，每个谱峰代表一种肽段。MALDI-TOF-MS分析肽混合物时，能耐受适量的缓冲剂、盐，而且各个肽片几乎都只产生单电荷离子，因此MALDI-TOF成为进行分析PMF的首选方法。

3. 肽谱图鉴定的优缺点？

通过测定蛋白质肽谱图分析蛋白质序列的方法的优势在于此项技术只用经过以及质谱分析来对蛋白质进行分析，测定的速度较快，而且因为蛋白质序列的特异性，肽谱图法可以推断出可信度较高的蛋白质，也较为精准。但是由于肽谱图测定需要依赖数据库信息比对，因此，对于数据库不包含的蛋白质，肽谱图不能够进行准确分析。

4. 准确度高的蛋白质测序法有哪些？

虽然理论上蛋白质酶切产生的肽段图谱是特定的，但是影响蛋白质酶切，以及鉴定肽段质量的因素众多，因此，肽谱图对蛋白质测序来说还是一种比较粗略的测定方法，更为精准的蛋白质测定方法包括Edman降解测序法，串联质谱测序法等。

5. 如果蛋白样品中含有多个蛋白质，有什么方法可以一次性对所有蛋白质进行测序的吗？

MS/MS质谱鉴定可以检测一个蛋白条带中的多个蛋白质，只需要将蛋白胶切下来送测序即可，在这个过程中保证切胶使用的刀具是干净无污染的，同时避免切下旁边的杂蛋白。质谱鉴定公司会对胶样中的蛋白质进行酶切，再测定肽段序列，然后将肽段序列与已知蛋白数据库进行比对，即可获知胶样中蛋白质的ID，并推测出蛋白的序列。

6. Edman降解法能够对所有蛋白质进行测序？

Edman降解测序法的优势是能够对未知的蛋白质进行测序，目前这项技术已经近乎完善，但是Edman也有一定的局限性。例如，Edman讲解法测序不能够解决蛋白质N端环化、封闭的测序问题，另外被修饰的蛋白质不能给出确切的信号，这些都在一定程度上限制了Edman降解法的广泛应用。

7. 对未知的蛋白质来说，如果蛋白质的N端有环化封闭现象，或者N端有未知修饰时，如何对蛋白质序列进行准确分析呢？

对于序列未知的蛋白质，特别是经过改造后的重组蛋白质，体外合成蛋白质，以及改造的抗体，或者基因序列未被研究过的蛋白质，这类蛋白质的信息往往不包含在蛋白质数据库中。要实现对这类蛋白质序列的准确分析就必须通过蛋白质从头测序的方法。蛋白质从头测序法是一项基于质谱技术的分析方法。与传统质谱鉴定的方法类似，从头测序法也是先将蛋白质酶切成小的多肽片段，接着经由高效液相色谱对多肽片段进行分离，再依次通过两级质谱对多肽片段序列进行测定。相较于传统质谱测序，从头测序经过精密的算法，保证鉴定的多肽序列，能够高准确度推导的蛋白质序列，并且能够不依赖于数据库比对，实现蛋白质序列从头测定。

8. 如何对蛋白质测序结果进行验证？

如果一个蛋白质的序列被成功鉴定了，那么Western blot是很好的验证方法。由于Western blot方法的特异性和灵敏度，因此，通过Western blot验证的蛋白质几乎可以100%确定蛋白质鉴定的准确性，排出质谱鉴定的假阳性。可以选取针对蛋白质上面某一段序列制备的单克隆抗体进行检测，再将Western blot的结果与鉴定的蛋白序预计分子量进行比对，即可确定蛋白质测序结果的准确性。

9. 已知蛋白质序列，如何对蛋白质结构进行预测？

蛋白质结构预测，即从蛋白质一级结构预测它的折叠和二级，三级和四级的蛋白质结构。目前有两种常用的蛋白质结构预测的方法：1. 同源建模法，通过已知同源或同一家族中蛋白质的结构，再对目标蛋白质结构进行推测；2. 折叠识别法，通过总结已知的蛋白质折叠法作为目标蛋白质折叠的模板，再根据数据库推测出匹配的目的蛋白质折叠的过程。

讲了这么多实验新手可能会关心的有关蛋白质测序的问题，但是大家实际遇到的问题各有不同，我们在这里就挑选一下具体问题进行回答

1. Edman降解测序是否可以测定含有大概130多个氨基酸的未知蛋白？
130个氨基酸序列比较长，已经超出了蛋白质Edman测序的限度，建议使用蛋白从头测序（de novo sequencing）对蛋白质序列进行测定。蛋白质从头测序不需要借助任何蛋白质数据库，可以对任何蛋白质，包括突变、经过生物改造的非天然蛋白质等进行测序。

2. 实验中通过Western blot鉴定出一种目的蛋白，分子量约29KD，想直接跑单向SDS-PAGE,然后切胶进行PMF，是否可行？PMF和Edman降解法那种更好？

使用SDS-PAGE分离，再将蛋白胶切下来做PMF是完全可行的。但是PMF比对的是肽谱图，存在一定的假阳性概率，因此对蛋白纯度的要求较高。所以，建议SDS胶跑开一些，保证切下来的蛋白胶不被其他蛋白胶影响，另外，切胶的时候注意不能被角蛋白等杂蛋白污染。PMF鉴定效率都比N端测序要更高，价格也更低。但是蛋白量、蛋白纯度足够高的话，PMF的结果也是同样可信的。