蛋白质定量技术及其在临床研究中的应用
蛋白质组学代表了某些细胞、组织或器官的表达、翻译后修饰以及蛋白质-蛋白质相互作用，已成为我们了解人类疾病和癌症分子机制和信号转导的重要手段。人体中的蛋白质水平处于稳定的平衡状态，蛋白质的积累通常会导致生物体质的变化，从而导致肿瘤发生或疾病。因此，蛋白质定量对于机理研究具有重要意义。本文就目前流行的蛋白质定量技术及其在临床研究中的应用作一概述。
基于HPLC-MS/MS的蛋白质组学技术
基于高效液相色谱串联质谱（HPLC-MS/MS）的蛋白质组学技术的发展主要取决于液相色谱-质谱联用分析设备、样品分离和制备技术、鉴定以及生物信息学。目前，shotgun鸟枪法是最常用的大规模蛋白质鉴定策略。如下图所示，在自下而上分析策略中，蛋白质通过蛋白水解酶水解成肽的混合物，然后通过色谱法或亲和分离技术进行分离，最后通过质谱检测碎裂离子。通过数据库搜库将质谱与数据库中蛋白质理论消化产生的谱进行匹配，并根据一系列指标进行评分，实现肽谱匹配（PSM），并最终完成蛋白质组鉴定。而在基于自上向下的蛋白质组学分析策略中，可以直接从样品中分离和检测完整的蛋白。与自下而上的方法相比，自上向下分析策略能提供更多保存蛋白物种的信息。这两种分析策略促进了疾病和癌症的蛋白质组学研究。
自下而上（a）和自上而下（b）基于质谱法的蛋白质组学工作流程（Jeong K等，2020）
蛋白质组学常用定量技术及其临床应用
Label-free定量（LFQ）
Label-free非标记定量蛋白质组学分析技术由于简单且侵入性最低而成为目前使用最广的蛋白质组定量策略。该技术不涉及其他生物分子，既方便又经济。但是，研究人员只能通过label-free定量方法获得蛋白质的相对数量。Label-free定量在临床研究中经常用于筛选肿瘤生物标志物，通常将肿瘤邻近组织或正常组织作为对照组。De Oliveira等人发现MMP-7是一种有前景的生物标志物，与通过label-free定量结果有效诊断胃腺癌患者有关。尿E-钙粘蛋白是发现糖尿病患者早期肾脏损伤的标志物。在Sun等人的研究中，采用label-free定量分析系统地比较了健康受试者和肺癌患者唾液和血清外泌体中的蛋白质谱，并发现了潜在的肺癌生物标志物。
真皮蛋白、载脂蛋白D、聚脂素、催乳素诱导蛋白和血清白蛋白是靶向蛋白质组学和无标记定量质谱研究中最丰富的汗液分泌蛋白，为形成皮肤化学屏障提供了潜在的汗液生物标志物。label-free定量还用于检测其他疾病和肿瘤的生物标志物，如帕金森病的Vps35、肝细胞癌的SOAT1、前列腺癌的GOT2、膀胱癌的A1AT。
细胞培养稳定同位素标记技术（SILAC）
SILAC是一种体内代谢标记法，无论对蛋白质的绝对定量还是相对定量都具有较高的准确性和可靠性。SILAC法将赖氨酸（13C或15N）和精氨酸（13C或15N）的同位素添加到缺少赖氨酸和精氨酸的细胞培养基中，将蛋白质标记为轻型和重型。通过质谱检测到的MS1水平进行定量分析，如下图。Fricke等人使用SILAC定量检测了TGFBR2缺乏性大肠癌中胞外囊泡的表达水平，发现了48个TGFBR2调控蛋白。SILAC策略常用于识别蛋白质和氨基酸的翻译后修饰（PTM），例如，Peng等发现在肝细胞癌中，过表达RNF38可通过泛素化和降解AHNAK促进TGF-β信号通路。Zhang等人通过SILAC定量比较了具有不同侵袭能力的食管鳞状细胞癌的组蛋白H3和H4的翻译后修饰，他们的研究有助于理解组蛋白翻译后修饰在不同的侵袭性ESCC细胞系中的不同表达。随着SILAC技术的发展，通过标记整个生物并将其组织用作内部标准品，实现了基于SILAC的模型生物组织定量蛋白质组学，从而阐明了SILAC在临床研究中的应用。
SILAC的工作流程（Shenoy A等人，2015）
相对和绝对定量等重同位素标签法（iTRAQ）
iTRAQ是由美国ABI公司于2004年开发的。依靠iTRAQ试剂盒，可以一次性标记多达8个样品，iTRAQ试剂包含报告基团、肽反应基团和平衡基团。报告基团的分子量为113Da至121Da，相关的平衡基团的分子量为32Da ~24Da，总分子量为145Da。iTRAQ技术可以比较不同样品中的蛋白质，具有良好的重现性和高灵敏度。可同时进行定性和定量分析。iTRAQ技术已在越来越多的领域中得到应用，如在医学研究领域中，iTRAQ可以分析和鉴定肿瘤组织中的差异蛋白以寻找生物标志物。Hjelle Sigrun阐述了iTRAQ在髓样白血病分子治疗靶标中的应用。Hu等人在肝损伤中鉴定了两个标志物，含量升高的膜结合的儿茶酚-O-甲基转移酶（MB-COMT）和含量减少的视黄醇结合蛋白4（RBP4）。
串联质量标签（TMT）
TMT法由Thermo Fisher公司开发，TMT可以同时定量多达16个样品。如下图所示，TMT试剂也包含报告分子、标准化分子和胺反应性基团。TMT旨在在不牺牲蛋白质鉴定和蛋白质定量质量目标的情况下进一步增加能够同时分析的样品数量，并且其定量准确性更高。TMT也广泛应用于临床样本研究，Wu等人应用TMT标记了10例HCC患者的样本，发现纤溶酶原是HBV相关的慢性肝衰竭的预后生物标志物。在胃癌、神经胶质瘤和胶质母细胞瘤的生物标志物的发现中也可采用类似的分析策略。
除上述这些常用方法外，很多其他策略也可以用于定量蛋白质，例如差异凝胶电泳（DIGE）、同位素编码的亲和标记（iCAT）和SWATH。这些方法也可用于研究分子机制和生物标记。蛋白质定量技术对于寻找人类癌症的生物标志物、药物靶点选择和机制研究至关重要。这些技术十分强大，可以帮助研究疾病发生和肿瘤进展的机制，以及发现新的生物标记并阐明临床研究。
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