四种色谱分离技术

色谱法利用不同物质在不同相态的选择性分配,以流动相对固定相中的混合物进行洗脱,混合物中不同的物质会以不同的速度沿固定相移动,最终达到分离的效果。

色谱类型

根据分离机理的不同,色谱可分为五种类型:吸附、分布、交换、排阻和亲和。色谱分离方法包括吸附色谱、键合相色谱、离子交换色谱、亲和色谱和尺寸排阻色谱。

色谱原理

色谱的物理化学原理(Broekaert J et al.,2015)

几种色谱分离技术的比较

亲和色谱
亲和色谱是色谱分离技术的一个重要分支。它是一种液相色谱方法,利用固定相的结合特性吸附目标产物并实现分离和纯化。例如,酶和基质(或抑制剂)、抗原和抗体、激素和受体、外源凝集素和核酸碱基对等之间的特异相互作用,等可形成一种具有不溶性载体的相互作用物质,均可用作色谱固定相。然后可以从复杂的混合物中可逆地拦截另一方,以达到纯化的目的。亲和层析已广泛应用于生物分子的分离和纯化,是分离纯化结合蛋白、酶、抑制剂、抗原、抗体、激素、激素受体、糖蛋白、核酸、多糖等生物大分子的重要方法之一。

亲和色谱

用于蛋白质纯化的亲和色谱的平衡(1),吸附/洗涤(2)和解吸附(3)步骤的示意图(Luana et al.,2012)

尺寸排阻色谱
尺寸排阻色谱(SEC)也称为凝胶色谱,利用分子筛使大小和数量不同的分子,根据各组分的排阻能力不同完成组分的分离。小分子量化合物可进入孔中并具有较长的停留时间,而大分子量化合物被阻止进入孔中,继续随流动相流动。当洗脱液为水溶液或缓冲液时,称为凝胶过滤色谱(GFC),在生物学领域应用广泛;当使用有机溶剂作为洗脱液时,称为凝胶渗透色谱(GPC),被广泛用于高分子领域。尺寸排阻色谱通常用于分离高分子化合物,如组织提取物、多肽、蛋白质和核酸。
凝胶过滤色谱基于蛋白质分子量或分子形状的差异对样品进行分离。当样品从色谱柱顶部向下移动时,大的蛋白质分子无法进入凝胶颗粒并被快速洗脱;而较小的蛋白质分子可以进入凝胶颗粒,并且较小的蛋白质进入凝胶的保留时间不同。分子量越大,洗脱时间越早,从而使具有不同分子大小的蛋白质被分离。

键合相色谱
根据分离组分在流动相和固定相中的溶解度不同,对样品进行分离。该方法使用一种特殊的液体物质涂覆载体表面,或与载体表面化学键合以形成固定相。涂覆固定(第一种操作方法)现在很少使用,化学键合固定相如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱,在工业上最常用。根据固定相和流动相的类型,液相色谱可分为正相色谱(NPC)和反相色谱(RPC)。随着柱填料的快速发展,反相色谱的应用范围逐渐扩大,现已应用于分析一些非极性样品或易分离的样品。

吸附色谱
吸附色谱法使用固体吸附剂分离混合物中的组分,常用的吸附剂是硅胶或氧化铝。该方法基于固定的相对组分吸附力的大小来分离各组分。整个过程取决于吸附-解吸的平衡。这种分离方法适用于分离分子量为200-1000的异构体以及非离子化合物。局限性是离子化合物的分离容易拖尾。

参考文献
1. Kecskemeti A, Gaspar A. Particle-based liquid chromatographic separations in microfluidic devices – A review. Analytica Chimica Acta, 2018.
2. Broekaert, J.A.C. Daniel C. Harris. Quantitative chemical analysis, 9th ed. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2015(407): 8943–8944.
3. Luana Cassandra Breitenbach Barroso Coelho, Andréa Santos, Maria T.S. Correia, et al. Protein Purification by Affinity Chromatography, Intech Open, 2012.
4. Wong, Min-Liang. Shirts off to boost separation methods. Nature, 2017, 543(7646):491-491.

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